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实验七 植物原生质体的分离与融合
实验目的：
掌握原生质体分离的方法；
了解并掌握利用PEG原生质体融合的原理和方法。
实验原理：
PEG为一种高分子化合物，能与水、蛋白质、和碳水化合物等一些基团能形成氢键。普遍认为聚乙二醇分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂 类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用， 从而使细胞发生融合。
该方法的优点是： 用法简单，容易获得融合体，融合效果好。
三、实验材料：
（1）韭菜或大蒜叶；
（2） 红辣椒
四、实验步骤：
Ι 植物原生质体的分离与纯化
1、将撕去表皮的植物叶片和果肉置于酶液（PH 5.4_6.0,去表皮面接触酶液），在15-30℃黑暗条件下， 酶解120分钟。
2、用350目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣（过滤完滤布洗净晾干）。
3、 在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。 红辣椒800转/分离心5分钟。
加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心 ，弃上清液。
加2ml 13%CPW洗液悬浮。
4、蔗糖漂浮法去除碎片。
** 蔗糖漂浮方法：
（1）用细口吸管吸20%蔗糖溶液约4ml，小心插入盛有原生质体悬液的离心管底部，缓缓将蔗糖溶液挤出，由于比重不同，蔗糖溶液与原生质体悬液中间有一明显界面(注意要有明显界面).
(2)离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），此时死细胞及碎片降至蔗糖溶液内，聚集在离心管底部，而活细胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界面处
(3)用细管吸取漂浮在上下界面处的健康原生质体，转入干净的离心管中，加入3～4ml13%CPW洗液离心（镜检决定是否需要离心），离心5分钟（1000转/分，辣椒800转/分），收集沉淀，最终原生质体体积控制在0.5ML左右。
Ⅱ 细胞融合
不同的原生质体各300μl与带盖离心管中，另加入300μl 40% PEG液，30℃水浴中温浴15min；
融合液一滴于载玻片上(注意保持一定湿度，不能太干)，轻轻盖上盖玻片，显微镜观察。
五、实验结果：
用光学显微镜或倒置显微镜(高倍) 观察2-3个细胞 靠近或 融合的过程。（ 观察时注意不同程度的融合现象。通常分为五个阶段。① 两细胞膜接触， 粘连；②细胞膜形成穿孔；③ 两细胞的细胞质连通；④通道扩大，两细胞连成一体；⑤ 细胞完全合并，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。）
六、实验作业
绘制原生质体融合的基本过程；
简述细胞融合的原理
做细胞融合实验时，应注意哪些问题？
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