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第十四章 电泳分离技术; 一、电泳技术概述; 电泳技术概述;电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 ;蛋白质分子在不同pH下的解离状态;u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分) V:泳动速度:cm/秒or分 E:电场强度:伏特/cm ;泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量、颗粒大小和形状有关。 被分离的球形分子在电场中所受的力(F)为： F = E Q 式中 E：电场强度，即每厘米支持物的电位降；Q为被分离物所带净电荷。 ;（??）、影响电泳速度的因素; 影响泳动度的因素 ; 影响泳动度的因素; 影响泳动度的因素; 影响泳动度的因素; 影响泳动度的因素;三、电泳的分类;按分离原理分类;;1.连续系统： 缓冲液的离子成分、PH、凝胶浓度、电位梯度都相同，带电颗粒电泳时仅具有电荷效应、分子筛效应。 2.不连续系统： 缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续，带电颗粒电泳时具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。;分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。;;㈠、凝胶电泳;1、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D—半乳糖和3、6—脱水—L—半乳糖结合的链状多糖。 ;琼脂;琼脂凝胶电泳：常用pH6-9;离子强度0.02-0.05;硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液；浓度常用1%-1.5%。 琼脂凝胶电泳的优点： 近似自由界面; 液固相间无明显界面，电泳速度快; 不吸收紫外线，可直接用紫外检测仪测定; 容易染色易洗脱.;琼脂糖凝胶电泳的基本操作;;;在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系: 共价闭环超螺旋结构DNA直线DNA 双链环状DNA ;2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)早在1959年由Raymends和 Weintraub．L建立。1964年，此法进一步从理论和实验技术上得到改进并推广应用。由于具有较高的分辨率和灵活性，目前已被广泛应用于蛋白质等生物大分子的分离和分析。 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理; 聚丙烯酰胺凝胶构成;;■ 联丙烯酰胺单体聚合过程：;;聚丙烯酰胺凝胶的优点;一些概念;凝胶的浓度和交联度;凝胶的浓度和交联度;在浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。因此，把浓度为7.5% 凝胶称为标准胶。 对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。;连续胶与不连续胶: 连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变 不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化;;;;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③pH的不连续性; ⑴．样品浓缩效应;; ⑵．分子筛效应 ;图中圆球分别代表大、中、小3种不同分子量的蛋白质。大、中、小分子分别滞留在与分子大小相当的凝胶孔径中，不再前进，因而分离成3个区带。 ; ⑶．电荷效应 ;变性胶与非变性胶： 变性胶：胶电泳在蛋白质变性的状态下进行，主要指SDS变性条件下进行； 非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。; 3、SDS电泳;⑴.SDS原理 ;SDS与PAGE有什么区别？;H-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-C-O-S-O-Na+;;;SDS;;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）;缓冲液;主要试剂及相关问题：;主要试剂及相关问题：;凝胶浓度及其分离范围;SDS电泳装置;实验步骤;灌注分离胶;灌注浓缩胶;根据需要插入不同的梳子;拔梳子后形成点样孔;点样，电泳;;蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有: 考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法。;染色液配制： 0.1% 考马斯亮蓝R250 (先用甲醇充分溶解) 50% 甲醇 10% 冰乙酸 40% 蒸馏水 滤纸过滤;硝酸银染色; 在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。; 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(Isoelectri