阿维菌素的液相色谱分析.pptVIP

阿维菌素的液相色谱分析 1.阿维菌素介绍 阿维菌素的产生菌———阿维链霉菌(Streptom yces avermitilis)是1975年日本北里研究所从日本静岗县的一个土壤样品中分离得到的.阿维链霉菌自发现以来,以日本北里大学和北里研究所以及美国Merk公司为主的研究小组分别对它开展了深入研究,形成了一个重要的抗生素研究领域.与其他链霉菌一样,阿维链霉菌不仅具有复杂的形态分化,也具有合成多种次级代谢产物的能力,由它产生的阿维菌素在医药、农业及畜牧业上有着重要的商业价值.目前对阿维链霉菌的研究主要集中在阿维菌素的生物合成领域. 2.阿维菌素结构 阿维菌素的天然发酵产物共有8个组分A1a,A21,A2a,A2b,B1a, B1b,B2a和B2b,它们的区别主要在于C25,C222,23和C226位所连接的基团不同。 3　仪器和试剂 高效液相色谱仪:具有紫外可变波长检测器;(岛津公司LC-10A 色谱数据处理机;(CLASS-10A工作站。) 色谱柱:150 mm×3.9 mm(id)不锈钢柱,内装Nova-Pak C18、5μm填充物;(Waters ) 过滤器:滤膜孔径约0.45μm; 微量进样器:50μL; 定量进样管:5μL; 超声波清洗器; 甲醇:色谱级; 水:新蒸二次蒸馏水; 乙腈:色谱级; 阿维菌素标样:已知阿维菌素(B1a+B1b)质量分数≥98.0 %。 4. 　色谱操作条件 流动相:甲醇+乙腈+水=38+38+24,膜过滤,并进行脱气; 流量:1.0 mL/min; 柱温:室温(温差变化应不大于2℃); 检测波长:245 nm; 进样体积:5μL; 保留时间:B1a15.6 min, B1b11.3 min。 典型阿维菌素乳油高效液相色谱图见图 5.溶液的配制 5.1标样溶液的制备 称取阿维菌素标样0.05 g(精确至0.00 02g),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。 5.2试样溶液的制备 称取含阿维菌素0.05 g的试样(精确0.0 002 g),置于100 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀。 6.测定 在上述操作条件下,待仪器稳定后,连续注入数针标样溶液,直至相邻两针阿维菌素峰面积相对变化小于1.5 %后,按照标样溶液、试样溶液、试样溶液、标样溶液的顺序进行测定。 7.计算 试样中阿维菌素(B1a+B1b)的质量分数X1(%)按式(1)计算 式中: A1———两针标样溶液,阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值; A2———两针试样溶液,阿维菌素B1a与B1b峰面积和的平均值; m1———标样的质量,g; m2———试样的质量,g; p———标样中阿维菌素(B1a+B1b)的质量分 数,%。 8.结果和讨论 8.1线性关系试验 在一定质量范围内,按照浓度递增的顺序配制数个已知样,按上述操作条件进行分析。以阿维菌素标样质量为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。此标准曲线通过原点。计算得回归方程为Y=2.52×108X+4.69×103,线性相关系数r =0.9999。试验证明当阿维菌素浓度在0.004 g/100 mL~0.2 g/100 mL之间(进样体积5μL)与其相应的峰面积呈现良好的线性关系。 8.2　方法精密度试验 对阿维菌素原药、乳油按上述操作条件进行多次重复测定,试验表明该定量方法具有较好的精密度。其标准偏差分别为0.32、0.0089,变异系数分别为0.34 %、1.1 %。 8.3　方法准确度试验 称取数个已知含量的阿维菌素原药、阿维菌素乳油试样,分别加入一定量的阿维菌素标准品,按本方法测定其中阿维菌素总质量并计算回收率。阿维菌素原药、乳油的平均回收率分别为99.9 %、100.4 %,表明该方法具有良好的准确度。 8.4　最佳操作条件的选择 8.4.1　检测波长的确定 由阿维菌素的紫外光谱图可以看出,阿维菌素B1a和B1b的最大吸收波长均在245 nm附近,由于流动相在该波长处无吸收且对B1a和B1b峰位置无干扰,故检测波长确定为245 nm。