细胞生物学教学课件第2章 细胞生物学的研究方法.pptVIP

第二节 生物化学分析技术 3. 扫描隧道显微镜 其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于‘隧道效应’而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。 Binnig、Rohrer等(1981)发明： 荣获1986年诺贝尔奖！ 据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵 第一节 形态观察技术 (scanning tunneling microscope, STM) 扫描隧道显微镜的分辨率很高（横向为0.1-0.2nm,纵向可达 0.001nm）。 扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到纳米科学水平。 其优越之处：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 第一节 形态观察技术 扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像 第一节 形态观察技术 亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。 4. 冰冻蚀刻技术 冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。 第一节 形态观察技术 (freeze-etching) ①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。 ②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构——蚀刻(etching)。 蚀刻 断裂 (2) 冰冻蚀刻技术的操作步骤: 第一节 形态观察技术 ③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。 复膜 ④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 第一节 形态观察技术 (3) 细胞冰冻断裂后的电镜图像 第一节 形态观察技术 二、免疫细胞化学 三、显微光谱分析技术 四、放射自显影术 五、超离心技术 六、分子杂交技术 七、PCR技术 一、组织化学与细胞化学技术 八、层析技术 FACS技术 免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。 如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 二、免疫细胞化学(immunocytochemistry) 第二节 生物化学分析技术 常用的标记物有荧光素和酶： 标记荧光素的称为免疫荧光法(immunofluorescent technique)，常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。 标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-labelled antibody method)，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。 第二节 生物化学分析技术 抗体与抗原的结合方法可分为以下两种： 第二节 生物化学分析技术 直接法 间接法 将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位 在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体与初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，增强显示效果 间接免疫细胞化学法的原理示意图 次级 抗体 初级 抗体 标记物 第二节 生物化学分析技术 第一抗体（一抗） 第二抗体（二抗） 用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态 第二节 生物化学分析技术 IRS-1 IRS-1+Bcl-2 Bcl-2 放射性同位素发射出的各种射线能使照相乳胶中的溴化银晶体还原(感光) 。利用放射性物质使照相乳胶膜产生该物质自身影像的技术，称为放射自显影术。 放射自显影的切片用染料染色后，便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或定量测定。 四、放射自显影术 第二节 生物化学分析技术 (autoradiography) 由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记(14C和3H均为弱β放射性同位素，半衰期长: 14C为5730年; 3H为12.26年)。 一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H-尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，则分别选用3H-氨基酸和3H-甘露糖、3H-岩藻糖等。 第二节 生物化学分析技术 常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷显示DNA的放射自显影图像 第二节 生物化学分析技术 放射自显影技术与电镜技术结合，也可进行电镜自显影（electron-microscopic autoradiography）。 电镜自显影照片 * * 第二章 细胞生物学的研究方法 Chapter 2 How cells are studied 第四类研究方法技术