《生物化学》课件-生化试验技术.pptVIP

生化实验技术专题 目录 第一节 生物大分子物质的制备 生物大分子分离纯化的一般步骤 注意事项 宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 第二节 几种重要的生物化学实验技术 一．层析技术（chromatography） 层析技术原理 层析法分类（按装置分类 ） 氨基酸分析仪图解 层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 各类层析的原理和载体 吸附层析（absorption chromatography） 分配层析 分子筛层析（gel-filtration chromatography） 离子交换层析（ion-change chromatography） 亲和层析（affiuity chromatography） 聚焦层析（Chromatofocusing） 几种主要层析方法比较 二 、 电泳技术 电泳的一般原理 电泳技术分类（按实验装置分类） 常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS 等电点聚焦（isoelectric focusing） 免疫电泳immunoelectrophoresis 毛细管电泳 毛细管电泳装置示意图 三、 离心技术 超速离心机工作原理图解 沉降系数（S） 生物分子的检测 核酸操作技术 一、核苷酸序列测定 二、Western-blotting、Northern-blotting 三、PCR 一、核酸的序列测定 Sanger：双脱氧链终止法和Gilbert：化学法 双脱氧链终止法的技术基础： １、凝胶电泳分离DNA单链片段时，小片段移动快，大 　　片段移动慢。 ２、用合适的聚合酶可以合成出与单链DNA互补的链。 ３、反应体系中包括：单链模板、四种脱氧核苷酸、合 　　适的引物、一定比例的2 ′, 3 ′ -双脱氧核苷三磷 　　酸（ddNTP)以及若干种适量的无机离子。 酶法测定DNA序列的原理 二、核酸印迹 Southern-blotting：Southern印迹。指经过凝胶电泳分离的DNA片段转移到合适的固相载体上，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。 Northern-blotting：通过凝胶电泳使完全变性的RNA按照大小分离，然后通过印迹技术将RNA分子转移到固相支持物上，固定后采用特异探针进行杂交，用于基因表达特异性分析和定量分析。 三、PCR 聚合酶链式反应（polymerase chaireaction,PCR） 为一种在体外快速扩增特定基因或DNA的方法，又称为无细胞 克隆技术。 常规PCR主要步骤 PCR流程图 反向PCR：可以使靶序列两侧 的未确定区段得以扩增 毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（?2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。 高压电源 光源 光电倍增管 数据采集 毛细管 缓冲液-样品 缓冲液 1．离心机类别 普通离心机 ?6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 ?3万转/分 2．沉降系数（S）概念 3．超离心法类别 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium） 光源 转轴 转头 样品池 光学系统 液面 沉降界面 沉降物质 平衡池 沉降界面峰 浓度对距离的图谱 生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。其单位用Svedberg，即S表示，S=1×10-13秒。? 沉降系数（S）与分子量（M）的关系 M = RTS D(1-??) Svederg方程: 1、蛋白质的测定 凯氏定氮法（含N量? 6. 25） 双缩脲法、Folin-酚法 紫外光度法（?max=280nm） 离心沉降法、电泳法、层析法 2、酶活力的测定 终点法、动力学法 3、氨基酸的测定 茚三酮法