酶的分离纯化工程分析.ppt

注意的问题： ①盐析后要及时脱盐。②用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如分级有机溶剂沉淀，分级盐析，连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。 ④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。 ⑤分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。⑥得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，－20℃ 或－70℃保存 五、酶的活力测定与纯度测定 1.酶的活力测定与比活性 ——评价提纯方法好坏的指标 总活力的回收率 反映提纯过程中酶活力的损失情况 比活力提高的倍数 反映纯化的效率 在酶纯化的每个阶段，都需要进行上述测定 两者合理安排，但通常不可兼顾，根据具体情况取舍。 2.纯度鉴定： 方法很多，检验是否还有继续纯化的必要 由于酶分子高度复杂，不同方法检验出的结果可能不同 酶纯度要注明：电泳纯、层析纯、HPLC纯。 鉴定依据： 酶分子的大小、形状：超速离心法、凝胶层析等 酶分子的电荷性质：离子交换层析、电泳等 酶分子的化学性质：一级结构测序（N端或C端） 酶分子的溶解度：Northrop分析法 酶分子的抗原性：免疫双扩散、单抗法 Northrop分析法 在一定体积溶剂中，一种蛋白质在溶液中溶解的量曲线（X-总蛋白，Y-溶解的蛋白），有一个折点，斜率先为1，后为零，而如果有几种蛋白，则不同 总蛋白量 上清中的蛋白量 0 用提纯的酶免疫动物，可获多抗，如果酶不均一，可出现不只一条沉淀线 免疫沉淀法 六、酶的保存 主要任务： 维持酶的天然构象 保证酶的催化活性 （一）影响酶稳定性的因素 温度： pH值和缓冲液 氧 酶蛋白的浓度和纯度 温度： 一般情况：低温条件（0-4℃）保持活性 很多酶可以冷冻（-20℃）保存 有些酶冷冻保存失活， 如鸡肝线粒体的丙酮酸脱羧酶，兔肌糖原磷酸化酶 可能原因：低温使得亚基间疏水键减弱，相间变化时的机械破坏，溶质冰晶化与蛋白质结合水间相互关系的改变，等等 pH值与缓冲液 缓冲液： 在某个区域有缓冲作用，因酶而异 不同缓冲体系的影响 磷酸盐缓冲体系：盐的溶解度对温度有依赖性，低温会造成局部pH的变化，使酶失活 Tris-Cl体系：温度系数大，但是缓冲范围窄，pH7.5以下缓冲能力弱，对某些酶有抑制作用 氧： 部分酶在空气中不稳定，易缓慢失活 巯基保护剂：防止巯基被氧化 嫌气处理：充氮或者充氩保存，等等 酶蛋白浓度和纯度 稳定性：低浓度＜高浓度＜结晶或干粉 低浓度酶液很容易失活，与亚基解离，容器壁吸附和表面变性等有关 许多酶的粗制品比精制品更稳定 碱性磷酸酶： 粗品冻干粉－20℃保存2年以上 精品冻干粉 半年左右 （二）酶的各种稳定剂 底物、抑制剂和辅酶 顺乌头酸酶：加柠檬酸 D－氨基酸氧化酶 加：安息香酸钠（竞争性抑制剂） 加：辅酶FAD 酶分子处于局部扭曲状态，结合上述物质，降低能级，趋于稳定 -SH基保护剂： 半胱氨酸（Cys），谷胱甘肽(GSH),β-巯基乙醇（ME)，二硫苏糖醇（DTT）等 巯基参与结合、催化底物，组成别构部位，维持高级结构，维持活性 其他： 无机离子、金属盐、有机溶剂、甘油、蔗糖、表面活性剂等等 如：钙离子可以保护α-淀粉酶 20％丙酮（乙醇）保护苯甲醇脱氢酶 * * 制备酶，首先要选择适当的生物材料。材料的来源主要是动物、植物和微生物及其代谢产物 * * 注意预冷 * * 改变离心力，使得各成分依次分开 * * Northrop分析法 Northrop分析法：在一定体积溶剂中，一种蛋白质在溶液中溶解的量曲线（X-总蛋白，Y-溶解的蛋白），有一个折点，斜率先为1，后为零，而如果有几种蛋白，则不同 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） SDS(十二烷基磺酸钠)--阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，使蛋白质舒展。并且每2个氨基酸与一个SDS结合，使