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H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定 H9亚型禽流感病毒的分子生物学鉴定 1材料与方法 　　1.1毒株  　　H9N2亚型AIV、H3N8亚型AIV、H4N6亚型AIV、H5N1亚型AIV、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性法氏囊炎病毒（IBDV）、鸡新城疫病毒（NDV）等毒株由中国农业大学动物流感研究室保存并提供。  　　1.2引物的设计、合成与筛选  　　根据H9亚型禽流感病毒的HA基因的序列，通过DNAman 软件进行比对，找出HA基因的保守区，针对HA基因的保守区序列设计特异性引物，并在Genbank上进行Blast检测比对分析，用Oligo 4.0软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送上海生工生物技术有限责任公司北京合成部合成。合成了针对HA基因的5对引物，用中国农业大学流感研究室分离保存的H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定引物对。确定上游引物H9-F：5prime;-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3prime;；下游引物H9-R：5prime;-ACCAACCTCCCTCTATGA-3prime;；退火温度为53 ℃。目的片断长度为425 bp。  　　1.3主要试剂  　　TRIzol Reagent 由invitrogen公司生产；反转录试剂盒K1622，Fermentas；氯仿、异丙醇、乙醇等均为市售；GoldenView由北京索莱宝公司生产。  　　1.4H9N2亚型AIV病毒含量的测定  　　取感染H9N2亚型禽流感病毒A/CK/SD/ZB/2007的尿囊液，作10倍倍比稀释，每个稀释度接种3枚鸡胚（0.1 mL/枚）。35 ℃孵育48 h，将鸡胚于4 ℃过夜，收获尿囊液，测定其血凝效价，按Reed-Muench法计算半数感染量。  　　1.5病毒RNA的提取与cDNA的合成  　　取感染H9N2亚型AIV毒株A/CK/SD/ZB/2007的鸡胚尿囊液Trizol法提取病毒的总RNA，将干燥的RNA用11 mu;L DEPC 水溶解，立即做RT-PCR的扩增或-80 ℃保存备用。  　　将Unit 12（10 mu;mol/L）1 mu;L加到含RNA的11 mu;L DEPC 水中，瞬时离心，70 ℃水浴5 min后，置冰上5 min。依次加入5AMV buffer 5 mu;L，dNTPs（10 mmol/L） 2 mu;L，RNasin （40 U/mu;L） 1 mu;L，MLV （5 U/mu;L） 1 mu;L，混匀，瞬时离心，37 ℃ 水浴1 h，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。  　　1.6反应体系和反应条件的优化  　　对RT-PCR反应体系和变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等条件进行优化，最后确定采用总体积为 25 mu;L 的反应体系：2PCR MIX buffer 12.5 mu;L；浓度为 20 pmol/mu;L HA上游引物H9-F 1 mu;L；HA下游本文由收集整理引物H9-R 1 mu;L；cDNA 2 mu;L；ddH2O补足至25 mu;L。最后确定RT-PCR最佳循环条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火35 s，72 ℃ 延伸35 s，34个循环；然后72 ℃延伸10 min。