《作物育种学总论》第17章分子标辅助选择育种.ppt

第十七章 分子标辅助选择育种 绪 分子标记辅助选择 (MAS) 的主要进展 1. 基因聚合 (gene pyramiding) 2 .基因转移 (gene transfer) 3. 数量性状的 MAS 分子标记的特点： （1）直接以DNA的形式表现，表现稳定 （2）数量多 （3）多态性高 （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别 纯合体和杂合体。 （6）成本不太高 分子标记的原理和遗传特性 (一)RFLP标记 1.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的 碱基替换、插入、缺失 或重复等，造成某种限 制性内切酶酶切位点的 增加或丧失，从而产生 限制性片断长度多态 性。 1）取50-200mg新鲜叶片，置液氮中研磨成粉。 2）将冻粉分配到两个1.5或2.0ml的离心管中, 加入提取缓冲液900μl, 轻轻搅动, 。 3）各加入100μl SDS，于65℃水浴中保温10-15min(间隔晃动2-3次)。 4）各加入160μl 5 mol/L KAc,充分混匀，冰浴中放置30min。 5） 4℃下12000rpm离心15min。 6）上清转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。 7）4℃下8000rpm离心10min。 8）上清转入另一离心管中，加入-20℃预冷的异丙醇，混匀，放置30min, 观察DNA沉淀生成。 9） 4℃下8000rpm离心10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。 10）用80%的乙醇洗涤沉淀，吹干10min。 1)在冰上做好针对不同DNA的100个PCR反应混合液（加样次序如下）： 水 1475μl 10×缓冲液 200μl 10×dNTPS 200μl 引物(20μmol/L) 20μl Tag聚合酶 5 μl 终体积 1900μl (分装100管) DNA（10-100ng） 每管1μl 一.分子标记的遗传基础 标记辅助选择的主要方面是对目标基因的选择，有人称之为前景选择（foreground selection）。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因间的连锁必须非常紧密，才能够达到较高的正确率。 PCR反应条件 反应体系： Buffer：2.5ul Tag：0.3ul Mg2+：1.0ul dNTP：1.5ul DNA： H2O： 总体积：25ul 反应温度 时间： 1.预变性： 95 4min 2.变性： 95 1min 3.退火： 45-65 45s 4.延伸： 72 90s Go to 2 for 34-45 cycle 5.延伸： 72 12min Incubate at 4℃ forever 选择的正确率随重组率的增加而迅速下降。重组值越小，其错选率越低。 对基因组中其他部分（即遗传背景）选择，称为背景选择（background selections）。背景选择的对象几乎包括了整个基因组，因此，这里牵涉到一个全基因组选择的问题，在分离群体中，由于在上一代形成配子时同源染色体之间会发生交换，因此每条染色体都可能是由双亲染色体重新组装的杂合体。 二.分子标记的优越性 1.克服性状表现型鉴定的困难 2.允许早期选择 3.控制单一性状的多个（等位）基因的利用 4.允许同时选择多个性状 5.可进行性状非破坏性评价和选择 6.从育种进程考虑，可加快育种进程，提高育种效率 三.分子标记辅助选择应具备的主要条件 A：与目标基因紧密连锁的分子标记 第二节 重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 How to use a genetic marker for marker-assisted selection 目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。用于MAS育种的分子标记须具备三个条件： 一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记 遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互