模块三 无菌操作技术.pptVIP

知识目标 学会处理各种外植体的方法和操作流程； 理解有菌和无菌的范畴； 记住外植体灭菌程序。 第一节 灭菌和接种 　　灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 第一节 灭菌和接种 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。茵的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不人。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 第一节 灭菌和接种 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。 二、无菌操作 接种时由于有一个敞口的过程，所以是极易引起污染的时期，这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起，接种室要严格进行空间消毒。接种室内保持定期用1%～3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗。 无菌操作步骤1 除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外，还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾，使空气中灰尘颗粒沉降下来。无菌操作可按以下步骤进行： （1）在接种4h前用甲醛熏蒸接种室，并打开其内紫外灯进行灭菌； （2）在接种前20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； 无菌操作步骤2 （4）上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； （5）先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干； （6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； （7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外灯灭菌30min。 注：若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。 三、接种 第二节 培养和驯化 指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 1培养方法 1．培养方法 （1）固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 （2）液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50-100r／min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 视 频 第五节　组培快繁的计划安排 要确定（或限制）增殖瓶数 考虑每天增殖与生根的比例。试验后确定，一般3：7。 快速繁殖由提高增殖倍数、缩短增殖周期，周年生产三因素决定。 实行有效的管理办法，达到人力物力的协调，从而提高生产效率 苗数及其它指标的计算 任务小结 将经过表面灭菌后的植物材料在无菌环境 中切碎或分离出器官、组织或细胞转移到 无菌培养基上的过程称为接种。由于整个 过程均在无菌条件下进行，所以将这个过 程称为无菌操作。 （1）外植体的选择与处理，（2）接种与 培养程序，（3）培养条件调控，（4）驯 化移栽等。 思考练习 1.初代培养◆ 2.继代培养◆ 3.生根培养◆ 培养步骤 2．培养步骤 2．培养步骤 丛生芽的发育Ⅰ 顶芽 腋芽 丛生芽的发育1 丛生芽的发育Ⅱ 丛生芽的发育2 不定芽的发育 不定芽的发育 石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程 体细胞胚状体的发育Ⅰ 体细胞胚状体的发育1 体细胞胚状体的发育Ⅱ 　外 植 体 特点：数量多，速度快，结构完整，成苗率高 愈伤组织 小孢子 游离单细胞 器　官 　胚 状 体 　试 管 苗 体细胞胚状体的发育2 原球茎的发育 缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。 原球茎的发育 视频3-5 初代培养 继代培养 扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段、分离芽丛、胚状体、原球茎。 培养基：基本培养基或分化培养基 实质：增殖培养物，为生产成品试管苗做准备。 继代培养 目的：扩繁无根苗，最后达到边繁殖边生根 视频3-6 继代培养 视频3-7 生根培养 生根培养 生根培养 生根培养 生根培养 生根培养