厌氧培养方法.docxVIP

厌氧性细菌的分离培养法 厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长 (例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至 0.11V 时才开始生长 )，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌 氧菌的生长。 为使培养基降低势， 降低培养环境的氧压是十分必要的。 现有的厌氧培养法甚 多，主要有生物学，化学和物理学 3 种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。 1．生物学方法 培养基中含有植物组织 (如马铃薯、 燕麦、发芽谷物等 )或动物组织 (新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等 ) ，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧 ( 如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理 )，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。 另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使 厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌 (如枯草杆菌 )，另一 半接种厌氧菌， 接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上， 并用石蜡密封， 置 37 恒温箱中培养 2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。 2．化学方法 利用还原作用强的化学物质， 将环境或培养基内的氧气吸收， 或用还原氧化型物质， 降 低氧化—还原电势。 此法系用连二亚硫酸纳 (Sodium hydrosulphite) 和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下： Na2S204 十  Na2C03  十  O2 一→ Na2SO4  十  Na2SO3 十  C02 取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内 (如系液体培养基，则直立于罐内 )，最上端保留可容纳 1~2 个平皿的空间 (视玻罐的体积而定 )，按玻罐的体积每 1000cm3 空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各 30g，在纸上混匀后， 盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿， 但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐， 则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭 (如图１－５ )。 （２）焦性没食子酸法 焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大重氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙 (Purpurgallin) 。每 l00cm3 空间用焦性没食子酸 1g 及 10％氢氧化纳或氢氧化钾  l0ml ，其具体 方法主要有下列几种： 1）单个培养皿法： 将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在 其上放焦性没食子酸 0.2g 及 10％ NaOH 溶液 0.5mL 。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放人 37C 温箱培养 24~48h 后，取出观察。 2） Buchner 氏试管法： 取一大试管，在管底放焦性没食子酸 0.5g 及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入 20％ NaOH 溶液 0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡， 37 培养 24~48h 后观察 (图１－６ )。 ３） 玻罐或干燥器法： 置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻 罐内置美蓝指示剂一管， 从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底， 将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后．将线放下，使焦性没食子酸落人氢 氧化纳溶液中，立即将盖盖好；封紧，置温箱中培养。 ４）瑞 (Wright) 氏法： 将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后，塞人管中离培养基 1~1．5cm 处， 置适量焦性没食子酸于其上， 加入 10％ NaOH 溶液 2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧， 以胶泥 或石蜡严密封闭置温箱中培养 (图１－７ )。 ５）史 (Spray) 氏法： 用图１－８所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将 已接种的平皿翻盖于皿上， 并将接合处用胶泥或石蜡密封完全， 然后摇动底部， 使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。 ６）平皿法： 置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食 子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培养（图１－９） 。 ７）硫乙醇酸钠法 硫乙醇酸钠 (HSCH2COONa) 是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原性物质， 促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素 C、半胱氨酸等。 ．液体培养基法： 将细菌种人含 0.1％的硫乙醇酸钠液体培养基中， 37℃培养 24~48h 后观察，本培养基中加 美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色。 Ｂ．固体