动物细胞培养常用方法.doc

精品 一. 细胞增殖周期（ cell proliferatinal cycle ）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。 而细胞增殖周期主要 是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念， 两者不应混为一谈。 细胞增殖周期是指 细胞从一次分裂结束开始生长， 到下一次分裂结束所经历的过程。 根据细胞增殖 周期不同时期的生化特点， 划分为四个连续的时期， 即 G1 期（DNA 合成前期）， S 期（DNA 合成期），G2 期（DNA 合成后期），M 期（有丝分裂期）。如以 G1 期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着 G1-S-G 2-M 的顺序进行，G1 、S、 G2 三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。 M 期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期 = 间期（G1 期+S 期+G 2 期）+ 分裂期（ M 期）。 二. 培养细胞生命期（ life span of culture cells ） 很多细胞特别是正常细胞， 在体外的生存不是无限的， 而是具有一个生命期。 索维培养细胞生命期， 是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 培养细胞的生 命期与细胞的种类、 性状和原供体的年龄、 健康等情况有关。 人胚二倍体成纤维 细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传 30~50 代，相当于 150~300 个细胞 感谢下载载 精品 增殖周期， 能维持 1 年左右的生存时间， 最后衰老凋亡。 如供体为成体或衰老个 体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代 或十几代。 只有当细胞发生遗传性改变， 如获永生性或恶性转化时， 细胞的生存 期才可能发生改变。 正常细胞培养时， 不论细胞的种类和供体的年龄如何， 在细 胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三. 培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的， 当细胞增殖达到一定密度后， 则需要 分离出一部分细胞和更新营养液， 否则将影响细胞的继续生存， 这一过程叫传代 （Passage 或 Subculture ）。每次传代以后， 细胞的生长和增殖过程都会受一定 的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、 接种细胞的数量和细胞增殖的速度 等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与 饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快） ；连 续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快； ；培养液中血清含量多时细胞增 殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成 感谢下载载 精品 为培养工作中的一种习惯说法， 它与细胞时代或倍增非同意含义。 如某一细胞系 为第 20 代细胞，即指该细胞系已传代 20 次。在细胞一代中，细胞能倍增 3~6 次。细胞传一代后，一般要经过以下六个阶段：游离期、贴壁期、潜伏期、指数 增长期、停滞期、衰退期。 四. 无菌操作要求 （一） 实验前培养室和超净台的消毒。在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和 培养用液用紫外线照射； 工作台面上的用品不要过多或重叠放置， 否则会遮挡射 线，降低消毒效果；一些操作用具，如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用 75% 酒精擦拭后置台内同时紫外线照射消毒。 （二） 无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞，必要物品，如试管架、移液器或 吸管头等可以暂时放置， 其他实验用品用完后应及时移出， 以利气体流通。 试剂 瓶口和外壁要用 75 ％酒精擦拭后才能带人无菌操作台内。超净台上的物品布局 要合理，污物废液缸、 酒精棉球缸在右侧位， 酒精灯在中央区， 试剂瓶在左侧位。 实验操作应在操作台中央无菌区域内进行，勿在边缘非无菌区域操作。 （三） 洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，双手用肥皂洗净后，浸 泡于消毒液中，并用 75％的酒精擦拭。 （四） 操作中，小心取出无菌实验用品，避免造成污染。尽量减少手与器材的 接触面，学会手指操作。手指不能触及器材使用端及容器瓶口，如触及，需要更 换或烧灼后再使用。 组织、细胞及培养板在未做处理和使用前， 不要过早暴露于 空气中。 （五） 一切操作，如打开或封闭瓶口，安装吸管、注射器等，都要在酒精灯火 焰前方进行。瓶口、吸管、注射器等使用前要经过火焰烧灼后使用。但要注意， 感谢下载载 精品 金属器械不能在火焰中长时间烧灼， 以防退火 c 另外， 胶塞、 橡皮乳头及塑料制 品等细胞培养用品过火焰时也不能时间太长， 以免烧焦产生有毒气体， 危害细胞。 （六） 试剂瓶顺风斜放在支架上，培养瓶、培养液瓶不要过早打开。容器打开 后，用手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用，尽量避免垂直放置以防止下 落细菌的污染。 吸取液体前， 瓶口和吸管应行火焰