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发酵过程中无机磷的被利用和ATP生成 一、实验目的 1. 了解ATP生物合成的意义 2. 掌握无机磷的测定方法 3. 掌握DEAE-纤维素薄板层析 二、实验原理 酵母在发酵过程中利用无机磷，使AMP ATP，随着发酵时间的增长，无机磷含量降低，ATP含量上升。测定无机磷的方法：无机磷+ 钼酸 磷钼酸络合物，后者再与还原剂反应，生成钼蓝，在A660nm有吸收峰。 三、实验器材 1. 分光光度计（660nm），比色皿 计算纸（9 cm×9 cm） 2. 37℃水浴 3. 离心机 （离心管100ml 、50ml） 4. 紫外分析仪260nm/254nm 5. 玻璃板 （5.5cm×15cm） 6. 烘箱（60℃）或吹风机（冷/热风） 7. 微量加样器（20μl） 四、实验器材 1. 2% 三氯乙酸 2. 3M 硫酸- 2.5%钼酸铵（V:V=1:1） 3. a-1,2,4氨基萘酚磺酸钠 0.25g还原剂加15g NaHSO3及0.5g Na2SO3用蒸馏水定容100ml，用前稀释3倍） 4. 6 M KOH 5. AMP 6. KH2PO4,K2HPO4 , 酵母, MgCl2 , 葡萄糖 7. ATP （临用前配50mg用蒸馏水溶解，定容至5ml） 8. 1M HCl （处理纤维素用） 9 1M NaOH （处理纤维素用） 10. 0.5M pH 3.5 柠檬酸钠缓冲液 11. DEAE—纤维素处理，供全班用 ；提前铺板2块， 60℃烘干 五、实验步骤 准备4支洁净试管，编号1~4，各加入2.5ml 三氯乙酸 发酵 （100ml足够20组用） 称取 0.5g KH2PO4 ,2.9g K2HPO4 ,0.08g MgCl2 , 2.5g葡萄糖 0.5gAMP用50ml蒸馏水溶解，再称取25g酵母研成粉后和上述溶液混合，并加蒸馏水至100ml，混匀后转移至250ml烧杯中，并立即取样0.3ml加入试管1中混匀，并将烧杯立即置入37℃水浴。 五、实验步骤 3. 发酵液处理 以后每隔30分钟，将烧杯摇匀后，取一次样（0.3ml），分别加入试管2,3,4中混匀，将试管1~4液体过滤得到的上清1~4用作以下实验。 五、实验步骤 3. 发酵液处理 以后每隔30分钟，将烧杯摇匀后，取一次样（0.3ml），分别加入试管2,3,4中混匀，将试管1~4液体过滤得到的上清1~4用作以下实验。 五、实验步骤 4. 无机磷的测定 说明：本试验不用计算无机磷的绝对量，故不用做标准曲线。A660nm下降即无机磷下降，随着发酵时间增加，无机磷消耗也增加，而ATP增加 五、实验步骤 5. DEAE-纤维素层析测定核苷酸 1）DEAE-纤维素处理 先用水洗，抽干后用4倍体积1mol/LNaOH溶液浸泡4h（或搅拌2h），抽干，蒸馏水洗至中性，再用4倍体积1mol/L HCl浸泡2h（或搅拌1h）抽干蒸馏水洗至pH4备用。 2）铺板 将处理过的DEAE—纤维素放在烧杯里，加水调成稀糊状，搅匀后立即倒在干净玻璃板上,涂成均匀的薄层，放在水平板上，自然干燥或60℃烘干，备用 3）点样 在已烘干的薄板一端2cm处用铅笔轻划一基线，用微量点样管取样液10μl②，点在基线上，用冷风吹干。 五、实验步骤 5. DEAE-纤维素层析测定核苷酸 4）展层 在烧杯内置pH3.5柠檬酸钠冲液（液体厚约1cm）,把点过样的薄板斜插入烧杯内（点样端在下），溶剂由下而上流动，当溶剂前沿到达距玻板上端约1cm处（10min左右）取出薄板，热风吹干，260nm紫外线照射DEAE—纤维素层观看斑点（图）。DEAE—纤维素经处理可反复使用。此法具有快速、灵敏的特点。