大肠杆菌培养操作规程.docVIP

. 大肠杆菌培养操作规程 一、 目的及适用范围 制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA的操作。依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。 二、 常规时间安排 预计安排 步骤 耗时评估 第一天 耗材准备 20min 储存液配置PBS 40min 培养基配制 20min 灭菌 3h 领取菌种 10min 第二天 菌种复苏 9h 接种 40min 分装培养 13h 完全提取根据需求，自行安排。RNA 培养用耗材准备三、 1、 锥形瓶、双层铝箔、棉绳 2、 康宁冻存管1ml的枪头，50ml包扎一盒 早上)培养基配制四、 ( 培养基应现配现用，每次配置 350ml，一次性使用完毕。 500ml锥形瓶中：LB1、 按下表称取物资配置培养基到 ] [例如：配制350mlLB培养基配方如下：配置双份 成分名称 蛋白胨 TRYPTONE 氯化 钠 酵母提取物YEAST XTRACT 去离子水 称取质量 3.5g 3.5g 1.75g 350ml 补足 2、 用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。待灭菌。 五、 PBS溶液配制 1 / 3 . 量是否充足，如充足PBS、 10XPBS不需要每次生产都配置，生产前跟检查1 则可跳过该步骤。配储存液，取10XPBS缓冲液备用；例如配制1000L10XPBS1000ml2、 配制 液瓶，根据下表称取各物质。用去离子水定容至1000ml。 称取量名称 10X 浓度 1000ml O H280.0g NaCl 2.0g KCl 14.4g HPO Na422.4g KHPO423、 将PBS溶液混合均匀，包扎好，待灭菌。 六、 灭菌 1、 将配置好的PBS溶液，培养基，1ml枪头准备好。 2、 确认灭菌锅内水位是否达到标准水位，若未达到，则加入纯化水至标准水位。 3、 将包扎好的培养基、PBS溶液和枪头盒一同放入灭菌锅。注意PBS盖不可太紧，盖紧灭菌锅盖，须旋紧；设置各参数：121℃，20min。 4、 灭菌结束后，待灭菌锅压力降至“0”，打开灭菌锅盖；取出灭好菌的培养基和枪头盒。 5、 PBS、培养基放置于室温静置2h，待完全冷却。枪头盒放入80°C鼓风干燥箱三小时烘干。备用。 6、 冷却至室温后，进行活化。 七、 菌种复苏（下班前） 1、 打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。 2、 在超净工作台内进行菌种复苏接种操作，打开50ml冻存管管盖后，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口，打开处理好的培养基瓶，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口，倒10ml培养基至50ml冻存管中，用酒2 / 3 . 精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口后将培养基瓶密封待用。0 3、 吸取400μL菌种到已加培养基的50ml冻存管中，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口后盖好冻存管管盖，震荡混合均匀。 4、 标记冻存管，并培养：恒温培箱，恒温培养8h，设置参数：37℃，220r/min。 八、 接种（第二天早上） 1、 提前半小时打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。 2、 在超净工作台内进行接种操作，在开盖后及封盖前均须将瓶口或管口用酒精灯灼烧灭菌处理。 3、 接种量为：1:100。例如：300ml培养基，取出DH5α菌种瓶，打开后用酒精灯外焰旋转焰灼烧瓶口灭菌，吸取3ml DH5α菌种加入到培养基中，用酒精灯外焰旋转灼烧菌种瓶口灭菌后盖好盖子，用酒精灯外焰旋转灼烧培养基瓶口灭菌后盖好盖子，摇匀接种后的培养基。 4、 接种操作结束后，在培养用的器具上标注：DH5α、日期、编号。 5、 入摇床培养。（时间同菌种复苏） 6、 下班前拿出。 九、 分装培养（第三天早上） 3 / 3