实时荧光定量PCR检测的数据处理及结果报告幻灯片.pptVIP

实时荧光定量 PCR 检测 的数据处理及结果报告 卫生部临床检验中心 李金明 1 基本概念 ? 线性基线期 (Linear base-line phase) 为 PCR 扩增的四个主 要阶段之一（图）。线性基 线期为扩增最初的 10~15 个循 环，此时， PCR 反应处于起 始阶段，扩增产物很少，所 产生的荧光信号很低，因此， 基线荧光信号可根据此阶段 产生的荧光信号来计算。 2 基本概念 ? 指数期初期 （ The beginning of exponential phase ） 为 PCR 扩增的四个主要阶段之 一（图）。进入扩增指数期 初期，荧光强度达到一个阈 值，该阈值通常为基线荧光 信号均值标准差的 10 倍。扩 增达到阈值时的循环数可称 为 CT （ ABI Prism 有关文献） 或 CP （ LightCycler 有关文 献）。 CT 或 CP 与原始扩增模 板数量正负相关，可通其与 原始模板的函数关系，来计 算原始模板的数量。 3 基本概念 ? 指数期（ Exponential phase ） 为 PCR 扩增的四 个主要阶段之一（图）。 PCR 达到其最大的扩增阶 段，理想条件下，每一循 环后， PCR 产物倍比增加。 4 基本概念 ? 平台期（ Plateau phase ） 为 PCR 扩增的四个主要阶 段之一（图 5-1 ）。扩增 达到平台期，此时，荧光 信号不再随扩增循环数的 增加而增加 。 5 基本概念 ? Ct 值（ threshold cycle ）或 CP 值（ crossing point ） Ct 或 CP 值指的是实时监测扩增过程的 荧光信号达到指数扩增时的循环周期数。主要 的计算方式是以扩增过程前 3 到 15 个循环的荧 光值的 10 倍标准差为阈值，当荧光值超过阈值 时的循环数则为阈值循环数（ Ct ）。有实验证 明 Ct 值与样本中的原始拷贝数成正比关系。 Ct 值是当前实时荧光 PCR 的主要定量参数。 6 基本概念 ? 扩增效率 E （ amplification efficiency ） 扩增 效率指的是一个循环后的产物增加量与这个循 环的模板量的比值，其值位于 0 到 1 之间。在 PCR 的前 20 或 30 个循环中， E 值比较恒定，为 指数扩增期，随后 E 值逐步降低，直至 0 ，此时 PCR 达到平台期，不再扩增。扩增效率的计算 可以采用系列稀释法，将稀释后浓度的对数值 与所得 Ct 值做图，在一定范围内应该是得到一 条直线，利用公式（ 1 ）： E=10 -1/K -1 （ K 为该 直线斜率）即可计算出 E 值。 7 基本概念 ? 绝对定量（ Absolute quantitation ） 绝对定量是使用一系列稀释 的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定，根据系列浓度标 准品的 Ct 值与起始模板（ RNA 或 cDNA ）量之间的线性比例关系， 绘制标准曲线。待测标本的浓度则可根据其测定的 Ct 值，从标准 曲线或回归方程计算得到原始模板的数量。这种方法是假定所有 的标准品和临床标本有相近的扩增效率。系列稀释标准品的浓度 应包含临床标本的浓度范围，并且在实时 PCR 仪及检测试剂方法 的准确度和线性范围内。 系列稀释的标准品最好是 RNA ，也可以是双链 DNA 片段、单链 DNA 或载有靶序列的质粒。标准品必须是纯的，与 RNA 标准品相 比， DNA 有相对较好的稳定性、重复性和敏感性，但其与逆转录 没有关系，不能反映逆转录效率。 8 基本概念 ? 相对定量（ Relative quantitation ） 在相对定 量中，标本中特定 mRNA 的测定是建立在外标 或参比样本（校准品）的基础上的。当使用校 准品的时候，定量测定结果可表示为靶 RNA/ 校准品比值。有多种数学模型可用来计算相对 定量测定的平均正态化的基因表达。使用不同 的数学模型所得到的结果和标准差均会有所差 异。表 5-1 比较了不同的数据处理方法及其解 释。 9 10 基本概念 ? 标准品（ Standard ） 用来构建标准曲线的已 知浓度的样本。 ? 参比（ Reference ） 用于对检测结果进行标准 化的被动（ Passive ）或主动（ Active ）信号。 如内标和外标即为主动性参比的例子。主动性 参比意味着信号由 PCR 扩增所致，主动性参比 有其自己的引物和探针。被动性参比则为非 PCR 所致，如 ROX 染料，可以校正荧光信号的 非 PCR 波动。 11 基本概念 ? 内源性内标（ Endogenous control ） 为一个出现在每 一个实验样本中的特定 RNA 或 DNA ，通过使用内源性 内标这种主动性参比，对于加入到每一个反应中的