修改--培养基配制注意事项.docx

邹梦廉撰写，赵培修改。 物品存放位置：3个1000 mL三角瓶、6个封口膜（每瓶两个，目前套在瓶子上的比较干净，最好不要另找）、皮筋在水池一侧第二个条台靠过道的实验桌下柜子里。三角瓶用前要用大试管刷和自来水刷洗干净，再用蒸馏水润洗（蒸馏水在白色的方桶里）。 试剂在墙边远离水池数来第二个柜子里，是个试剂柜，第二层有氯化钠，第三层有蛋白胨（英文是peptone，千万别与胰蛋白胨tryptone搞混了），琼脂agar在第四层。 1 M 氯化钙、1 M硫酸镁、1M 磷酸钾缓冲液在超净台里。 另外胆固醇和三角瓶放在一个位置，胆固醇不要照紫外。 灭菌前配制：每瓶配600 mL：氯化钠1.8g，琼脂15g，蛋白胨1.5g，称量时注意天平水平，用经蒸馏水润洗的量筒加590 mL左右的蒸馏水，不用搅拌。 高压灭菌：高压灭菌锅在水池靠门边，要把篮子提出来，加蒸馏水至微微没过底部（底部外围是有沟的），少加会干锅，多加后如果是盒子，可能会积水很多。放回篮子，把三角瓶垒上。试剂瓶的盖子盖好后稍松一圈。开电源后调温度121 ℃，时间30 min（默认为20 min，用温度/时间切换钮按到“TIME”指示灯亮，用上箭头跳到30 min），“开始”。排气是自动的。因为有恒温期前升压、恒温期后降压的过程，实际用时可能为1.5 h以上。待压力表示数为0时盖子才打的开。要及时把边台上的水浴锅打开恒温在50-60 ℃。待灭菌锅内温度降到80 ℃可以取出三角瓶，放到水浴锅里降温到60 ℃左右（不那么烫手）后保温（水浴锅放不下三角瓶，可以轻微地转动瓶子使均匀接触水）。 平板的准备，从箱子里（超净台旁）取出平板（10个一小袋）剪开，放在超净台里照紫外至少15分钟。 倒平板：在超净工作台中操作（使用前开紫外灯15分钟，使用中要开通风），打开酒精灯，戴手套，用75%酒精消毒手套（喷壶里）。用灭菌枪头（超净台中）向每个三角瓶中分别加入600 μL 1 M 氯化钙、600μL 1 M 硫酸镁、15 mL 1M 磷酸钾缓冲液（用一个长的、最大刻度为15 mL的管子来量）、600μL 胆固醇（最后加，特别要摇匀，否则容易结块），加时封口膜不要离瓶口太远，要摇匀（但不要太剧烈，因为较低温时琼脂越摇越容易凝结，而且会起泡，影响之后的观察）。倒平板时始终留四五个在下面垫着提供操作高度，一手一个个从下往上拿起盖子（及其上的一摞），一手倒培养基，一定要尽量平（手的位置基本固定），要防止倒出的培养基反复回流污染。一批培养基倒得要尽量差不多高，否则镜检时要经常调焦，大概是在盖子扣上后其下边缘以上的体积。倒好后摞整齐（防止因不平而倾斜），放置超净台角落等待凝结。 平板倒好，凝固，降温后可以铺板，一般在倒完后至少4个小时后进行，如果温度高，可能烫死大肠杆菌（尤其是在中间的降温慢）。 加大肠杆菌：大肠杆菌在离周四班果蝇培养箱近的冰箱中，冰箱门最下层一个橙色盖子的试管里。在超净台中操作，记得开关试管前要在酒精灯上烧一下灭菌。用1 ml的枪加菌液，每次一到两滴。与倒平板相似，一摞一摞滴加菌液。滴加时枪头尽量举高一点，让菌液摔在平板上，可以使菌液更分散。注意枪头不要碰到培养皿，如果碰到一定要换了枪头再继续，以免污染菌液。大肠杆菌是么有抗性培养出来的，新摇的大肠杆菌在大规模滴板前需测试菌液是否无污染，做法跟上面一样，只不过铺5-10个平板，放37度培养2天，看有无污染后再决定是否大规模铺板，因为没有摇菌条件，菌液每次由助教来提供，都是测试后的。 刚铺好的板上，大肠杆菌的培养基没有被琼脂吸干，是流动的，此时不要移动平板，以免大肠杆菌流到板子边缘，这样培养线虫的时候会经常发现线虫爬丢了。一般静止几个小时后菌液就干了，这个时候就可以把平板倒放（upside down），倒放平板能防止过度蒸发而变干。 整理：倒完后一定要及时清洗用具，并放回指定位置。 铺好的平板在室温放置2天后，根据使用量，可以转移一部分到4度冰箱，依然倒置，这样能减慢蒸发速度，如要使用4度冰箱的平板只需要在使用前提前20分钟拿出来即可 重点： 1）天平调零 2）灭菌锅加水 3）60度左右才加胆固醇 4）板子别垒斜了，尽量厚度一致 5）铺板时无菌操作 6）菌液被吸收后再倒置 7）不能马上用完的平板及时放到四度冰箱