酵母双杂交[文字可编辑].pptVIP

酵母双杂交技术 主要内容 一 酵母双杂交技术的基本原理 二 酵母双杂交技术的应用 三 酵母双杂交技术的改造 四 结束语 一 酵母双杂交技术的基本原理 酵母双杂交系统的建立基于“真核生物 调控转录起始 ”。 酵母转录子 Gal4 分子由一条多肽链组成，含有 881 个氨 基酸。它有两个结构域： 1 、 DNA 结合结构域 （ DNA binding domain, DB ）由位于 N- 末端 1 ~ 147 个氨基酸构成，能识别位于 Gal 1 基因的上游激 活序列（ UAS, upstream activating sequence ） , 此外， 在其 N- 端还具有一段核定位序列； 2 、 转录激活结构域 （ activation domain, AD ）由位于 C- 末 端的 768 ~ 881 位氨基酸构成。 当 Gal4 的两个结构域位于不同肽链上，只要它们在空 间上充分接近，则能够恢复 Gal4 作为转录因子的活性 . 酵母转录子 Gal4 分子 768~881 AD ( activation domain ) Gal 1 基因 UAS （上游激活序列） Gal 1 基因 UAS N C 1~147 DB 768~881 AD N C 激活转录 1-147 DB （ DNA binding domain ） 不同 转录激活因子的 DB 和 AD 形成的 杂合 蛋白 仍然具有正 常的激活转录的功能。 DB 酵母细胞的 Ga14 蛋白的 DB AD 大肠杆菌的一 个酸性激活结 构域 B42 融合 结合到 Ga14 结合 位点 激活转录 Gal 1 基因 UAS AD DB DB AD 激活转录 Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立 他们以与调控 SUC2 基因有关的两个蛋白质 Snf1 和 Snf2 为模型， 将前者与 Ga14 的 DB 结构域融合，另一个与 Ga14 的 AD 结构域的酸性区 域结合。（形成融合蛋白） Snf1 Snf2 Ga14 的 DB Ga14 的 AD 诱饵 (bait) 猎物或靶蛋白 (prey or target protein) 如果 Snf1 和 Snf2 之间存在 相互作用 ， 那么分别位于这两个融合蛋白上的 DB 和 AD 就能重新形成有活性的转录激活因子， 从而激活 相应基因 的转录与表达。 这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎 物”相互作用的基因称为 报道基因 （ reporter gene ） X Y Ga14 的 DB Ga14 的 AD 诱饵 (bait) 猎物 ( prey) 报道基因 表达 报道基因的 基因产物 通过对报道基因 表达产物的检测 ，反过来可判别作为“诱 饵”和“猎物”的两个蛋白之间是否可存在相互作用。 常用的报告基因有： HIS3 ， URA3,LacZ 和 ADE 等。如 HIS3 ，可以通过该基因是否 表达在选择性培养基上筛选含有相互作 用蛋白的酵母； LacZ 基因（β - 半乳糖苷 酶基因），在 X-Gal 存在时利用它的颜色 反应对选择培养筛出来的阳性克隆作进 一步筛选。并可通过测定颜色反应的强 弱，分析蛋白 X 、 Y 间的相互作用的强弱 。 Fishing with the yeast two-hybrid system X Y d o e s X b i n d w i t h a p r o t e i n ? b a i t p r e d a t o r in other words is there a protein Y? To find out we are going to go fishing with the two-hybrid system. W e w i l l u s e X a s b a i t . . . . t o t r y t o c a t c h Y . As reference in this description, here is how the yeast two-hybrid expression system works. Fishing with the yeast two-hybrid system X Y d o e s X b i n d w i t h a p r o t e i n ? b a i t p r e d a t o r transcription machinery X Y bait prey lac 2 ? -galactosidase X-gal blue color p r o t e i n X b a i t c D N A f o r X