第九章反义核酸简介解析.pptVIP

Effector Step ? siRNA binding ? siRNA unwinding ? RISC activation RNAi 技术 Vectors expressing siRNAs U6 H1 siRNA Vectors expressing siRNAs U6 Sense sequence Anti-sense sequence Hair-pin loop Sense sequence Anti-sense sequence RNAi 的应用 ? 1 、功能基因组的研究 ? 在功能基因组研究中，需要对特定基因进行功 能丧失或降低突变，以确定其功能。由于 RNAi 具有高度的序列专一性，可以特异地使 特定基因沉默，获得功能丧失或降低的突变， 因此 RNAi 可以作为一种强有力的研究工具， 用于功能基因组的研究。 RNAi 技术高效、特 异、低毒性、周期短、操作简单等优势是传统 的基因敲除技术和反义技术所无法比拟的。 第九章 反义核酸 ? 反义核酸技术（ antisense nucleic acid technology ）是根据核酸杂交原理设计的以 选择性地抑制特定基因表达为目的的一类 核酸研究新技术，它包括反义 RNA （ antisense RNA,asRNA ）、反义 DNA （ antisense DNA,asDNA ）及核酶 （ ribozyme,RZ ）三大技术领域。 ? 该技术不仅对于从反向遗传学的角度研 究特定基因的功能及 RNA 的剪切、加工 和转录、翻译调控等具有重要理论意义， 而且对于开发作用于基因水平上的高度 特异性新型抗病毒和抗肿瘤药物等具有 重要的实用价值。 一 反义 RNA ? 20 多年前，首先在原核细胞中发现一种通过与 mRNA 互补形成双链结构而调节基因表达的 RNA 分子，称之为 asRNA 。真核细胞中也具有 asRNA ，但功能不十分清楚。 ? · 近期研究表明：人工合成 asRNA 的基因并将 其导入细胞内，转录出 asRNA ，则能阻断该基 因的表达。这有助于从反向遗传学的角度了解 基因对细胞生长和分化的影响。同时也表明用 该法对肿瘤等基因病实施基因治疗提供了可能。 按 asRNA 的作用机制，可将其分为 三大类： ? 1 Ⅰ类：直接作用于靶 mRNA 的 SD 序列和编码 区。 ? · SD 序列（ shine-dalgarno,SD ）：起始密码子 AUG 和其上游 3-11 个核苷酸处一段 3-9 个核苷酸 序列，是 16SrRNA 结合的位点。 ? Ⅰ A 类：作用后直接抑制其翻译。 ? Ⅰ B 类：与靶 mRNA 结合后，引起双链 RNA 分子对 RNA 酶Ⅲ的敏感性增加，使其降解。 ? 2 Ⅱ类：与 mRNA 的 SD 序列的上游非编 码区结合，从而抑制靶 mRNA 的翻译功 能。 ? 3 Ⅲ类：直接抑制靶 mRNA 的转录。 ? （二） asRNA 的制备方法：与一般基因 克隆方法类似。 ? 1 as-cDNA 的制备。 ? 2 asRNA 表达载体的构建。 ? 3 asRNA 表达载体向细胞内的导入。 （三） asRNA 的应用： ? 目前在植物学领域和抗肿瘤与抗病毒方面研究 较多，主要有： ? 通过抑制植物特定花色素酶的活性而改变植物 开花的颜色。 ? 通过抑制导致水果腐烂的酶而延长水果的保存 期。 ? 用 asRNA 治疗某些基因病。 ? 用于动物的抗病育肿。 ? 用于肿瘤和病毒病的治疗。 二 反义 DNA ： ? 指一段能与特定基因结合并抑制其表达 的合成寡核苷酸，其长度一般为 20bp 左 右，也称反义寡核苷酸（ antisense aligodeodexynucleotide, ASON/ASODN ） , 其理论基础是碱基配对，因此，可以设 计任何感兴趣基因的 ASON 。 ? 理论上一个 15bp 长的寡核苷酸只能特异 性地结合整个人类基因组中的一个基因。 由此可见， ASON 是极具潜力的基因功能 阻断剂，对与致病基因有关的疾病的治 疗极具重要意义。会成为新一代基因治 疗的药物。 三 核酶（ ribozyme ） ? 是具有催化活性的 RNA ，它们大部分参与 RNA 的加工和后熟。 ? 背景 1982 年 Cech 发现四膜虫 rRNA 前体自我剪接 作用， RNA 有催化作用 ;1983 年发现 RNase P 中 的 RNA