柱层析实验报告材料.pdfVIP

柱层析分离色素 一、【实验目的】 1 ．了解柱层析的分类，掌握各种柱层析的原理。 2 ．熟练掌握吸附层析的原理和操作技术。 二、【实验原理】 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素 a 、叶绿素 b、 胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利 用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用 95%乙醇或无水乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据 混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分 离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入表面 积很大， 经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂 （如氧化铝或硅胶） ，当混合物的溶液 流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合 物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速 度下移，形成色带。继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过 程进行反复的吸附 - 解析 - 再吸附 - 再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。 本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚 提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附 柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行 洗脱，从而达到叶绿体主要的 4 种色素（叶绿素 a 、叶绿素 b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。 三、 【实验材料】 原料： 新鲜的菠菜叶 试剂 ： 1 ． 无水乙醇或 95%乙醇 5. 三氧化二铝 2 ． 石英砂 6 ．饱和氯化钠溶液 3 ． 丙酮 7. 水硫酸钠 4 ． 石油醚（ 60-90 ℃） 8 洗脱液：丙酮：石油醚＝ 1：9 器材 ： 层析柱（ 1×30cm）， 研钵， 蒸馏装置， 脱脂棉， 天平， 烧杯， 过滤漏斗， 玻璃棒， 锥形瓶， 分液漏斗， 试管 ， 铁架台 四、【实验操作】 1 ． 色素的提取： 20 克菠菜，加少许石英砂，再加 20 毫升无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液， 滤渣再用无水乙醇提取一次， 合并滤液， 滤渣再加入 30 毫升石油醚提取一次， 过滤， 合并滤 液，转移至分液漏斗中 , 再加入 40 毫升饱和氯化钠溶液震荡，弃去下层溶液，再分别加入 20 毫升水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至三角瓶中，加入无水硫酸钠干 燥 5 分钟，备用 . 2 ．样品的浓缩： 将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩余液体 5-8 毫 升左右，以备加样使用。 3 ．层析拄的制备： 15 克碱性三氧化二铝加入 30 毫升石油醚搅拌，浸泡 10min. 。在层 析拄内加入一团棉花在底部，再加入石英砂 0.5cm 以上，然后用石油醚半充满柱子，再 将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石 油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再填入石英砂 0.5 厘米高。 3 ．样品的分离层析：吸附层析分离色素 打开层析拄下部开关，向拄内加入 2 毫升浓缩液，至液体没入砂内， 再加入石油醚冲洗拄壁，液体浸入砂内，加洗脱液开始层析，可以看到不同色带如图片 1，直至第一条