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蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源： 浏览次数：2704 第一部分 蛋白质的表达、分离、纯化 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。 通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分 蛋白质的鉴定 电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺 凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词： 第一部分 蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在 胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意 义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同 时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆 菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平 远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过 菌量的 8 0%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌 BL21 中，在 37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有 6 个连续组氨酸残基的重组氯霉 素酰基蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA ）使 镍离子（Ni2+ ）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCA C）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB 液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用水配至 1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer ：100 mM NaH2PO4, 10 mM , 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 [6] IPTG 易生物仪器库： 易生物试剂库： 二、器材 ，，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌 BL21 菌株 于 5mL LB 液体培养基中（含 100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养 过夜。 2. 转接 1mL 过夜培养物于 100mL（含 100ug/mL 氨苄青霉素）LB 液体培养基中，37℃震荡培养至 OD600 = 0.6 - 0.8。取 10ul 样品用 于分析。 3. 加入 IPTG 至终浓度 0.5 mmol/l, 37℃继续培养 1-3h. 4. 12，000rpm 离心 10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70 ℃冰箱中。 二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离，纯化 1. NTA 层析柱的准备：在层析柱中加入 1mL NTA 介质，并分别 用 8mL 去离子水，8mL 上样缓冲液洗涤。 2. 重组蛋白的变性裂解：在冰浴中冻融菌体沉淀，加入 5mL 上样 缓冲液, 用抽吸重悬，超声波破裂菌体，用振荡器等轻柔的混匀样品 60min, 4℃ 12000rpm 离心 30 min, 将上清吸至一个干净的容器中， 并弃沉淀。取 10ul 上清样品用于分析。 3. 上清样品以 10-15mL/h 流速