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氯化钙法转化细菌质粒 实验原理 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入细菌受体细胞，使之获得新的遗传性状的实验技术。自然状态下，细菌细胞接受外源DNA的几率很低，经CaCl2处理后，细胞膜通透性发生暂时改变，成为易于接受外源DNA分子的感受态细胞（Compenent Cell）。 本实验中的pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性（ApR），转入大肠杆菌感受态细胞后，转化子可以在LB＋Ap平板上生长，而没有获得质粒的细胞对Ap是敏感的，它不能在LB＋Ap平板上生长，这样就筛选得到了阳性转化子。 菌株和试剂 菌株：大肠杆菌 E.coli JM83 培养基： LB液体 (不含抗生素):培养制备感受态的大肠杆菌 LB固体平板（含氨苄青霉素Ap 50μg/ml ） 筛选接受了质粒的转化子 质粒： pUC19 氨苄青霉素抗性 （ApR） 试剂： 0.1 mol/L CaCl2 制备感受态细胞用 操作一：制备感受态细胞 （教师已做） 1、挑取一个E.coli JM83 单菌落，接入少量LB液体中，37℃振摇过夜，次日取菌液1ml接到100ml的LB液体中， 37℃快速振荡（ 200～300rpm ）2～3小时， 待OD600＝0.3～0.4时，将菌液转移到灭菌处理过的预冷 离心管中。 2、4℃离心，6000rpm×5mins，弃上清，每100ml原始菌液加50ml预冷 的0.1mol/L的CaCl2 ，用tip反复抽吸，打散菌体，冰浴30-60分钟。 3、离心，尽量吸尽上清，留菌体，每100ml原始菌液加4ml预冷 的CaCl2 ，用tip反复抽吸，重悬菌体，即可用于做转化或加入15％甘油，－80OC保存备用。 操作二：质粒转化 （同学做） 混合：每个同学吸150?l感受态细胞悬液加入到新的1.5ml的离心管中， 1管/人,取上次实验制备的质粒2-10?l，与菌悬液混匀, 冰浴10min； 热激：离心管在42℃水浴锅放90-120秒钟,取出后立即放冰浴1-2分钟； 恢复培养：向管中加入LB液体0.5ml，37℃摇床(在302室)恢复培养 20 -30min； 在此实验间隙,每两个组的同学（8－9人）融化1瓶250ml的LB固体培养基，融化后每瓶加50mg/ml氨苄青霉素0.25ml，混匀，使得终浓度为50?g/ml, 倒平板12－13皿。 涂皿：取100? l已转化质粒的菌液，用玻璃涂棒均匀涂布于LB+Ap 的平板上，每个同学涂1皿。另外每个组（4－5人）取没有转化质粒的感受态细胞100? l 涂LB+Ap 平板作为对照，1皿/组。 培养：37℃培养12～20小时（302室）。 看结果：星期六上午 9:00 - 11:00 三个班都在302室 * * *