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第十八章 免疫细胞检测技术 永州职业技术学院医学技术系 杨晓斌 免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。 主要包括：淋巴细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、各种粒细胞、红细胞等。 细胞分离基本原理 根据各类免疫细胞独特的表面标志及其特殊功能，用体外或体内方法，对各类免疫细胞进行数量和功能测定，可以有效评价机体特异性和非特异性免疫功能。 不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 第一节 免疫细胞的分离与纯化 免疫细胞分离的方法很多，这些方法主要是根据细胞表面标志、理化性状及功能等方面的差异而设计的。 方法: 1.白细胞的分离 2.外周血单个核细胞的分离 3.淋巴细胞的纯化与亚群的分离 4.吞噬细胞的分离 一、白细胞的分离 自然沉降法 外周静脉血，肝素抗凝，由于红细胞沉降速率较白细胞快，可使白细胞与之自然分离。 吸取白细胞层后，离心洗涤，低渗处理使红细胞裂解，反复洗涤得纯度较高的白细胞悬液。 二、外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞（PBMC）：指淋巴细胞和单核细胞 (一)聚蔗糖-泛影葡胺分层液法 原理 红细胞密度：1.093 粒细胞密度：1.092 淋巴细胞和单核细胞密度：1.076－1.090 血小板密度：1.030－1.035 聚蔗糖－泛影葡胺分层液1.077±0.001 (Ficoll密度为1.020----浓度为6% hypaque密度为1.200----浓度为34%) Ficoll：聚蔗糖 hypaque：泛影酸钠，泛影葡胺 Ficoll-hypaque（F-H）分层液法是分离PBMC最常用的一种单次密度梯度离心分离法。 （二）Percoll分层液 Percoll分层液是经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性无刺激， Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经高速离心后可形成一个连续密度梯度，可将密度不同的细胞分离纯化。 三、淋巴细胞的纯化与亚群分离 PBMC悬液主要含淋巴细胞，但还混有单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板可采用下列方法去除，以获得高纯度淋巴细胞及其亚群。 （一）红细胞的去除： 采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。 （二）血小板的去除 离心洗涤2－3次，可去除大部分血小板。某些疾病情况下，可用胎牛血清梯度离心法去除。 （三）单核细胞和粒细胞的去除 1.粘附去除法：单核细胞和粒细胞具有黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性。洗脱液中主要含淋巴细胞。 2.羰基铁粉吞噬法：吞噬细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬后再用聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心，则单核细胞沉积管底。 （四）淋巴细胞亚群的分离 1.E花环分离法 原理：成熟的T细胞表面表达 SRBC-R，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞则不能。 经F-H分层液密度梯度离心，E花环形成细胞因密度增大而沉积于管底。用低渗法裂解花环中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。悬浮在分层液界面的细胞群富含B细胞 2.尼龙棉分离法 原理 B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不具此能力，借此可将T细胞与B细胞分离。 技术要点 用Focoll分层液分离血中的PBMC；将PBMC悬液加入尼龙棉充填聚乙烯塑料管内；孵育；洗脱；流出液内含有T细胞。重复灌洗除去管内残留的T细胞，再用洗脱液边洗边挤压塑料管，可得到B细胞 3.亲和板结合分离法 原理 用特异性抗体包被塑料平皿或培养板，表达特定膜抗原的细胞即与相应抗体结合而被吸附于平皿或培养板表面，悬液中为不表达特定膜抗原的细胞 技术要点 用已知的McAb包被反应板，孵育，洗涤；加入待分离的细胞悬液，孵育。抗原阳性细胞吸附反应板，抗原阴性细胞存在于非吸附细胞悬液中。 4.免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)分离法 原理 将抗特异细胞表面的抗体致敏到磁珠的上，形成IMB。待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。 分离方式 ①阳性分离 直接从细胞混合液中分离出靶细胞； ②阴性分离 用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化。 技术要点：以免疫磁珠纯化人B细胞为例 ①抗体包被磁珠 ②B淋巴细胞的分离 ③磁珠与B淋巴细胞的分离 阳性分离涉及到磁珠与细胞的解离。方法是37℃过夜，也可用商品化的分离系统进行抗原与抗体的解离，使解离的细胞既无抗体残留，又不改变其