PCR HPVDNA荧光定量检测标准操作程序PDF打印版.pdfVIP

学 海 无 涯 单位及实验室名称 项 目 编号：ASJYK-LAB-C-P-53 HPV-DNA 扩增荧光 日期：XXXX 年6 月21 日 检验科 定量检测标准操作程 版本：第一版，第1 次修订 第1 页，共3 页 序 1.目的：明确高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确 进行巨细胞病毒核酸定量的检测。 2.适用范围： 2.1 适用于进行高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测的检验人员。 2.2 适合仪器：LightCycler480 型核酸扩增荧光检测仪 2.3 方法原理：采用PCR 方法结合荧光探针的扩增技术 2.4 样品要求：宫颈脱落细胞 3.职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。 4.试剂来源：潮州凯普生物化学有限公司高危型人乳头瘤病毒核酸定量检测试剂 盒。 5.质控物：阴性、阳性对照及阳性参控品系列均来源于试剂盒 6.标准操作： 6.1 试剂准备（在试剂准备区操作） 6.1.1 将试剂盒及其它所需试剂置室温解冻（临用前取出，用后立即放回冰箱， 反复冻融不可超过三次），取出PCR MIX,室温下避光解冻，上下颠倒混匀后，8000 转/分钟10s 从试剂盒中取出DVA 聚合酶，8000 转/分钟lOs。 6.1.2 根据当次实验标本量，取出相应试剂 （1 管=17.5ulPCR MIX +0.5ul DVA 聚合酶）总的需求量于一管中（其余随即放回原温度保存），如所需要的管数为 n (n=标本数+1 空白管对照+1 管阳性对照) 取PCR 反应管转移至样本制备区。 6.2 样本处理(在样本处理区进行) 6.2.1.取宫颈脱落细胞样本0. 5ml~1ml(如果细胞数量少可以加大体积到2m1) 6.2.2. 13000 转/分钟离心1 分钟 6.2.3.弃上清，加入0.5m1 细胞保存液重悬细胞 6.2.4. 13000 转/分钟离心1 分钟，尽量弃干净上清 6.2.5.每样本加入50ul 细胞裂解液，充分振荡重悬细胞，煮沸10 分钟。 6.2.6. 13000 转/分钟离心10 分钟，保留上清备用(上清中为释放的DNA) 。 6.2.7 取上清2.0ul 作为PCR 扩增的模板，其余保存于一20 ℃ 6.2.8 在对应的PCR 反应管中分别加入2ul 处理好的样本DVA,空白对照、阳性对 照，盖 紧管盖，稍做离心(反应总体积为2o u 1/人份，每次反应需要设置一个阳性对照 以及一个空白对照) 。转移到检测区，放入相应的荧光PCR 检测仪内，记录样本 摆放顺序 6.3 PCR 扩增（在扩增区操作） 6.3.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。 6.3.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。 6.3.3 设置四种荧光检测通道的报告荧光、淬灭荧光;Passive Reference 选择 none(见表1) 1 学 海 无 涯 ASJYK-LAB-C-P-53 第2 页，共3 页 表1: 设置四种荧光检测通道 Detector Name Target Reporter Dye Quencher FAM 12 种高危型 HPV FAM none (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 66，68) HEM HPV16 HEX/JOE none ROX