测序技术的发展以及在生物学中的应用.pptVIP

测序技术的原理及应用 汇报人：胡安中 1 核酸的常识与PCR 一代测序-sanger 二代测序-焦磷酸法 单分子测序-瀚海基因 测序技术的应用 2 酸水解或酶水解 碱基(base)：主要指腺嘌呤（adenine，A）和鸟嘌呤（ guanine, G），胞嘧啶（ cytosine, C）胸腺嘧啶（thymine，T）和尿嘧啶（ uracil, U） 一、核酸的常识-核酸的组成 3 一、核酸的常识-核酸的结构 4 DNA结构 一、核酸的常识-PCR 模板、Taq DNA聚合酶、引物、dNTPs和Mg2+ PCR原理 视频原理 5 二、Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核酸顺序的方法。是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家Sanger等人于1977年发明的。 核心技术： 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子； 2、利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸酶聚合延伸，从而终止DNA链的增长。 6 什么是双脱氧核糖核苷酸——ddNTP？ Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 7 Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 8 测序pcr反应体系 ddNTPs，dNTPs，Buffer， DNA聚合酶，Template，1 Primer Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 视频原理 9 Sanger测序技术——双脱氧末端终止法测序 视频原理 10 三、高通量测序 高通量测序技术（High-throughputtsequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation” sequencingtechnology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。主 要 指 以Roche/454 焦磷酸测序、 Illumina/Solexa 聚合酶合成测序和 ABI/SOLiD 连接酶测序，为代表的测序技术 。人类全基因组约30亿个DNA碱基对（1）；因此使用一代测序对人类基因组进行全基因组测序在速度慢与测序成本高都急需突破。 （1）、Science（2001）291：1304-1351 人基因组总共3G。一般做全基因组测序需要30-40x的覆盖度（保证一定的测序质量），因此测序一次全基因组得到的数据量将有90-120G。 11 焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA  polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。 焦磷酸测序技术的反应体系：反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物：5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。 三、高通量测序——焦磷酸测序原理 12 三、高通量测序——焦磷酸测序步骤 1、待测DNA文库构建 将基因组DNA/cDNA片段打断至400-800bp，将用于后续的扩增测序的接头A和一段含有生物素的接头B连接到DNA片段上，会产生含有接头AA、AB、BB、BA四种DNA片段，然后与可结合生物素的磁珠结合，其中片段AA被洗脱掉，片段AB/BA/BB结合到磁珠上，通过变性处理回收含有接头A和接头B的单链DNA。 2、Emulsion PCR（乳液PCR） 将这些ssDNA分别单独与水油包被的直径大约28um的磁珠在一起孵育、退火，由于磁珠表面含有与接头互补的寡聚核苷酸序列，因此ssDNA会特异地连接到磁珠上。 同时孵育体系中含有PCR反应试剂，因此可以保证每一个磁珠结合的小片段都会在各自的孵育体系内独立扩增，扩增产物任可以结合到磁珠上。 反应完成后，破坏孵育体系并富集带有DNA的磁珠。经过扩增反应，每一个小片段都将被扩增大约100万倍，从而达到下一步测序反应所需的模板量。 13 三、高通量测序——焦磷酸测序原理 3、测序 将携带DNA的磁珠与其他反应物混合物，放入PTP板中进行测序。 PTP板上含有很多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法固定每个磁珠的位置以监测接下来的测序反应 测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP平板，每次只进一个碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸，这个焦磷