2019年食品营养成分分析.pptVIP

5 ．计算 氨基酸态氮（ % ） = C 为氢氧化钠标准溶液的浓度， mol/L; V 2 为用中性红指示剂滴定时消耗的氢氧化钠标准溶液体积， ml; V 1 为用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积， ml; m 为测定用样品溶液相当于样品的质量， g; 0.014 为氮的摩尔质量， g/mmol 5 ．说明及注意事项 （ 1 ）此法适用于测定食品中的游离氨基酸。 （ 2 ）若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定。 （二）茚三酮比色法 100 014 . 0 ) ( 1 2 ? ? ? ? m C V V 三、氨基酸的分离及测定 （一）薄层色谱法 1. 原理 2. 操作方法 （ 1 ）制板 （ 2 ）样品的制备 （ 3 ）点样 （ 4 ）展层 （ 5 ）显色 3. 计算 4. 说明： （ 1 ）定量测定各种氨基酸，可以点上不同浓度的氨基酸标准溶 液，所得图谱供比较和确定样品中的氨基酸含量。 （ 2 ）薄层扫描仪可定量测定薄层斑点。 （二）氨基酸自动分析仪 1 ．原理 利用氨基酸极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子 交换树脂在色谱柱上进行分离。当样液加入色谱柱顶端后， 采用不同的 pH 值和离子浓度的缓冲溶液即可将它们依次洗脱 下来 。洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨 基酸。 定量测定的依据是氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合 物的颜色深浅与各有关氨基酸的含量成正比 。 但脯氨酸和 羟脯氨酸则生成黄棕色化合物，故需在另外波长处定量测定。 2. 操作方法 （ 1 ）样品处理：测定样品中各种游离氨基酸含量，可以除去 脂肪等杂质后，直接上柱进行分析。测定蛋白质的氨基酸组 成时样品必须经酸水解，使蛋白质完全变成氨基酸后才能上 柱进行分析。 ? 酸水解的方法：称取经干燥的蛋白质样品数 mg ，加入 2m1 5.7mol/L 盐酸，置于 110 ? C 烘箱内水解 24 小时，然后除去过量的 盐酸，加缓冲溶液稀释到一定体积，摇匀。取一定量的水解样 品上柱进行分析。 如果样品中含有糖和淀粉、脂肪、核酸、无机盐等杂质， 必须将样品预先除去杂质后再进行酸水解处理。去除杂质的方 法如下 : ? 去糖和淀粉：把样品用淀粉酶水解。然后用乙醇溶液洗涤，得 蛋白质沉淀物。 ? 去脂肪：先把干燥的样品经研碎后用丙酮或乙醚等有机溶剂离 心或过滤抽提，得蛋白质沉淀物。 ? 去核酸：将样品在 10% 氯化钠溶液中， 85 ? C 加热 6 小时，然后用 热水洗涤，过滤后将固形物用丙酮干燥即可。 ? 去无机盐：样品经水解后含有大量无机盐时还必须用阳 离子交换树脂进行去盐处理 。 2 ）样品分析：经过处理后的样品上柱进行分析。上柱的样 品量视所用自动分析仪的灵敏度而定。一般为每种氨基 酸 0.1 ? mol 左右 ( 水解样品干重为 0.3mg 左右 ) 。 测定必须 在 pH5~5.5 、 100 ? C 下进行反应时间为 10~15 分钟，生成 的紫色物质在 570nm 波长下进行比色测定。而生成的黄 色化合物在 440nm 波长下进行比色测定。 3 ．结果计算 根据峰出现的时间来确定氨基酸的种类。从峰的高 度和宽度可计算氨基酸的含量。 用阳离子交换柱分离及测定氨基酸所得图谱如图 3.3 。 （三）气相色谱法 原理 将本身没有挥发性的氨基酸转变为适合于气相色谱分析 的衍生物 — 三氟乙酰基二丁酯。它包括用正丁醇的酯化和用 三氟乙酸酐 (TFAA) 的酰化两个步骤。将酰化好的氨基酸衍生 物进行气相色谱分析。 （四）液相色谱法 原理 蛋白质样品经酸或碱水解后再用丹磺酰氯进行衍生化作 用而溶解于流动相溶液中，采用高压液相色谱仪分离并用荧 光检测器进行测定，即可测定出各种氨基酸的含量。 四、个别氨基酸的定量测定 （一）赖氨酸的测定 1 ．原理 三硝基苯磺酸（ TNBS ）能与蛋白质的氨基反应，由于 蛋白质的 N- 末端的 α - 氨基和赖氨酸的 ε - 氨基是游离的， 所以能与 TNBS 起反应，反应后生成的 TNP- 蛋白质经部分酸水 解后分别产生含有 α -TNP- 氨基及 ε -TNP- 氨基的小肽碎片。 在酸性溶液中前者可用有机溶剂抽取除去，而酸溶液中留下 的 ε -TNP- 氨基含量即可在 340nm 处测定，此含量相当于蛋白 质中的赖氨酸的含量。 2 ．操作（略） 3 ．说明 （ 1 ）对于大