基于液质联用技术同时测定大鼠体内六种甾体皂苷及其在药代的动力学方面研究.pptVIP

基于 UHPLC-MS/MS技术同时测定 大鼠体内的六种甾体皂苷及其药 代动力学的研究 汇报人:孙萌 2015,4.20 关键词:甾体皂苷、 UHPLO-MSMS、大鼠血浆、药动学研究 摘要:超高效液相电喷射离子化串联质谱的技术被应用于同时测定大鼠血浆中 的知母皂苷H1(TH1)知母皂苷E1(TE1)知母皂苷E(TE),知母皂苷B-I (TB-Ⅱ),知母皂苷B-Ⅲ(TB-Ⅲ),AS-I。血浆样品加入内标物人参皂苷 RhI(GRh1)后用乙腈沉淀蛋白。色谱柱为 ACQUITYFTMBEH反相C1s柱 (100mm×2.lmmi.d,1.7μm),梯度洗脱,流动相为含有0.05%甲酸和5mM甲 酸铵的乙腈—水。六种甾体皂苷用三重四级杆质谱仪负离子电喷雾离子源,多 反映监测模式(MRM)进行定量。监测产生的离子对分别为:TH1,TE1 TE,TB-Ⅱ,TB-,AS-I以及内标GRh1的m/,1211.51079.6,935.5 773.4,9354773.5,9196757.4,901.57393,757.45953and637.34753 6种甾体皂苷方法学验证在曲线范围0.5-400ng/m下完成。日内和日间精密度 (RSD%)小9.4%,每个分析物的平均提取回收率在82.5%-97.8%之间。6种 甾体皂苷在准备和分析阶段的储存都是稳定的。大鼠灌胃BGE(丁基缩水甘油 醚)知母提取液,第一次采用此方法学测定大鼠体内六种甾体皂苜的浓度,进 行药动学研究。 l、 Introduction 中药知母,知母的地下根茎,百合科,在临床上经常用于治疗伤寒,咳嗽 便血,咳血等疾病。植物化学研究表明知母中含有甾体皂苷类,山酮类,蒽 醌类,苯丙酯类以及生物碱等化合物。甾体皂苷类为知母中药理活性最强的 部位。TH1,TE1,TE,TB-Ⅱ,TB-Ⅲ,AS-I这6个为主要的活性成分。它 们有多样的生物效应如抗血小板凝聚、抗炎、抗肿瘤、增强认知等作用。因 此,对知母这六种成分全方面的药动学评价更能理解其药理和临床作用 TLC、GC、HPLC等方法已被提出来检测知母中的甾体成分。但这些方法 的分析周期长或者灵敏度很低,而且也不适合凵服给药后生物样品的检测。 近年LC-MS技术被广泛应用于各种甾体成分的分析。在之前的研究中 HPLC-MS在选择性检测模式(SIM)下可检测血浆中的TB-Ⅱ和TA-Ⅲ。由于 单四极杆质谱检测的低灵敏度和低选择性,不适合知母口服给药后多成分的 药动分析。 UHPLC-MS/MS一个非常强大而且可靠的用于化学成分分析的工具 且质谱的多反映检测模式(MRM)有高灵敏度和高特异性。日前已被广 泛应用于复杂多靶点生物基质的确定。运用 UHPLC-MS/MS同时测定生物样品 屮知母的多种甾体成分还未见报道。 本文用全面的 UHPLO-MSMS方法来测定大鼠血浆中的甾体成分TH1 TE1,TE,TB-,TB-Ⅲ,AS-1。液相分离使用1.7μm粒径的柱子,确保其 高分辨率和分离速度。在负离子电喷射离子化质谱条件下,尽量确保各个单 体在分析时的高灵敏度。Fig1为它们的结构。使用这种方法,口服给药后知 母中的6种成分将被一一检测出来。 2、实验 2.1化学品和试剂 标准品TH1,TE1,TE,TB-Ⅱ,TB-I,AS-I和内标GRh均从上海 鼎瑞制药有限公司购得。LC-MSMs检测其峰面积,纯度超过98%。知母 的乙醇提取物由西安医院药物代谢重点实验室准备。化合物TH1,TE1 TE,TB-Ⅱ,TB-Ⅲ,AS-I千浸膏分别为3.1,7.1,28,46.2,22,和0.7mgg 质谱级别乙腈、甲酸铵和甲酸从 Fisher购得。超纯水由Mili-Q系统制得 别的试剂都是分析级别 22仪器和条件 色谱分析仪器为安捷伦1200系列,包括一个二进制的溶剂传送系统 ,在线真空除气器,自动进样器,恒温控制箱。化学成分在装备有 VanGuard予柱(5mm×2mmi.d,1.7um) ACQUITYFTM BEH反相C 柱(100mm×2.lmmi.d,17pm)上进行分离。流动相A为加有5mM的甲 酸铵的0.05%甲酸水溶液,流动相B为加有5mM甲酸铵的O.05%甲酸乙腈 溶液。线性梯度条件如下:Omin25%B,0.5min28%B,4min30%B,4.5 in100%B,7min100%B。然后化学成分保持在100%流动相B中2min 流速为0.3ml/min,进样体积5。柱温在测定过程过程屮保持40°℃ 50:50的乙腈-水冲洗注射器。 质谱检测在负离子模式下由配备有电喷射离子源的安捷伦6410三重 四级质谱仪执行。干燥气体温度维持在350℃,流速为1OL/min,氮气压 力40磅,毛细管电压-3500V。保压时间为200ms,质量分析