酶切注意事项与问题.docxVIP

一、 建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则， 即 10 个单位的内切酶可以切割 1μg不同来源和纯度 DNA 。通常，一个 50μl的反应体系中， 1μl的酶在 1X NEBuffer 终浓度及相应温度条件下反应 1 小时即可降解 1μg已纯化好的 DNA 。如果加入更多的酶，则可相应缩短 反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过 16 小时） 也可完全反应。 二、 选择正确的酶 不言而喻， 选择的酶在底物 DNA 上必须至少有一个相应的识别位点。 识别碱基数目少 的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。 假设一个 GC 含量 50%的 DNA 链，一个识 别 4 个碱基的酶将平均在每 44（ 256）个碱基中切割一次； 而一个识别 6 个碱基的酶将 平均在每 46（ 4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（ 3’或 5’突出端），也 可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物 都可以互相连接。相关信息参见目录的 Compatible Cohesive Ends And Rec leavable Blunt Ends 一文。 三、 酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。 酶应当是最后一个被加入到反应体系中 （在 加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合 ）。酶的用量视在底物上的切 割频率而定。 例如，超螺旋和包埋法切割的 DNA 通常需要超过 1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第 244 和 264 之 切割质粒 DNA 和 包埋法切割 DNA 。 四、 DNA 待切割的 DNA 应当已去除酚、氯仿、乙醇、 EDTA 、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。 DNA 的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第 252 页至 253 页之甲基化相关内容。 五、 缓冲液 对于每一种酶 缓冲液浓度应为 我们也相应提供 太大影响。  NEB 都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎 100% 的酶活性。 使用时的 1X 。 有的酶要求 100μg/ml的 BSA 以实现最佳活性。在这种情况下， 100X 的 BSA （10mg/ml ）。不需要 BSA 的酶如果加了 BSA 也不会受 六、 反应体积 内切酶活力单位的定义是： 1 小时内， 50μl反应体积中，降解 1μg的底物 DNA 所需的酶为一个活力单位。因此酶： DNA 的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。 为了将甘油的浓度控制在 5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的 10% （一般酶都贮存于 50%的甘油中）。 七、 混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们 推荐用枪反复吸取混合， 或是用手指轻弹管壁混合， 然后再快速离心一下即可。 注意： 不可振荡！ 八、 反应温度 大部分酶的反应温度为 37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为 50-65 °C 不等。参看第 244 页 Activity of thermophiles at 37 C。 ° 九、 反应时间 1 酶活单位的定义时间为 1 小时。如果加入的酶较多， 可以相应地缩短反应时间； 反之， 如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第 241 页酶在反应中的存活时间。 十、 终止反应 如果不进行下一步酶切反应， 可用终止液来终止反应。 在 NEB 我们使用如下反应终止 液： 50% 的甘油， 50mM EDTA （ pH8.0 ），和 0.05%溴酚蓝（ 10μl/50 μl反应液）。如果 要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（ 65°C 或 85°C，20 分钟）。热失活并 不能适用于所有的酶，详情参见第 240 页热失活表。此外，酚 /氯仿抽提也可以用于终 止反应。 十一、贮存 大部分酶应贮存于 -20 °C。少部分酶则须在 -70 °C 长期保存。详情请参见相关酶的 DATA SHEET 或目录相关部分。 10X BUFFER 和 100X BSA 于 -20 °C 保存。 BSA 与 NEBuffer 混合后保存，否则将会出现 BSA 沉淀。  不能 十二、稳定性 每隔 1-2 个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在 -20 °C 条件下十分稳定。高于 -20 °C 条件下稳定性将有所降低。 十三、对照反应 如果发现您的 DNA 底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法 如下： 将不加内切酶的底物 DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照 DNA （有