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生物化学实验讲义 中南民族大学生命科学学院 实验教学中心 2006-2-22 生物化学实验室规则 1 每个同学都应该自觉遵守课堂纪律，维护课堂秩序，不迟到，不早退，不大声谈笑。 2 实验前必须认真预习，熟悉本次实验的目的、原理、操作步骤，懂得每一操作步骤的意义和了解所用仪器的使用方法，否则不能开始实验。 3 实验过程中要听从教员的指导，严肃认真地按操作规程进行实验，并把实验 结果和数据及时、如实记录在实验记录本上，文字要简练、准确。完成实验后经教员检查签字同意，方可离开实验实。 4 实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆放整齐。公用试剂用毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实验台面和地上。实验完毕，仪器洗净放好，将实验台面抹拭干净，才能离开实验室。 5 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约。洗涤和使用仪器时，应小心仔细，防止损坏仪器。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障须立即报告教员，不得擅自动手检修。 6 实验室内严禁吸烟！注意水电安全，离开实验室前，必须关好水龙头，拉下电闸，严防发生事故！ 7 废液倒入专门的废液桶，固体废物和带残渣的废物不得倒入水槽或到处乱扔。 8 仪器损坏时，应如实向教员报告，并填写损坏仪器登记表，然后补领。 9 实验室内一切物品，未经本室负责教员批准，严禁携出室外，借物必须办理登记手续。 10 每次实验课由班长负责安排值日生。值日生的职责是负责当天实验室的安全、卫生和一切服务性的工作。 实验一 可溶性糖含量的测定——蒽酮法 实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理 学习求标准曲线方程—最小二乘法 掌握分光光度计的使用 实验原理 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。 反应式： 该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。 实验步骤 求标准曲线方程 取6只试管，按下表配制（移取）葡萄糖（G）标准溶液，沸腾7分钟取出，用自来水冷至室温，用721分光光度计比色，波长620nm，1＃管作为参比(保留)，求标准曲线方程。（G浓度为200μg／mL，蒽酮试剂：2克蒽酮／每升85%H2SO4） 管号 G（mL） 蒸馏水（mL） 蒽酮（mL） 1 2 3 4 5 6 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 2. 样品含糖量的测定 取菜叶（包菜和白菜两个样）准确称取1.00克剪碎研细后，放入大试管，加入25mL蒸馏水，煮沸10分钟，通过漏斗滤入250mL容量瓶中（可以抽滤），并用煮沸蒸馏水提取两次，滤液并入容量瓶中，滤纸上的残渣用水冲两次，冷却定容至刻度。 吸取0.5mL滤液于编号的三只试管中，以蒸馏水补足1.00mL；另吸取1.00mL滤液于另编号的三只试管中，加蒽酮试剂5.0mL（于冷水浴中操作），摇匀后于沸水浴中煮沸7分钟，取出冷却至室温，以求标准曲线的1＃管作为参比，用721分光光度计在620nm处测吸光度或透过率。 最小二乘法求标准曲线方程的公式： X：G的浓度（μg／mL）Y：吸光度A＝－㏒T 本实验要求相关系数r≥0.99 思考题 本法多用于测定什么样品？ 实验二 蛋白质含量的测定 —Folin-酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝法（Brodford法） 一 Folin-酚试剂法（Lowry法） 目的和要求 学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。 进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正确使用仪器。 原理 蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法是一般实验室中经常使用的方法。它们操纵简便、迅速，不需要复杂而昂贵的设备，又能适合一般实验室的要求，若作一般的浓度测定较为适应。Folin-酚法灵敏度高，较双缩脲法灵敏100倍。本实验采用的是Folin-酚法。 Folin-酚法所用的试剂由两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂，可与蛋白质中的肽键起显色反应。试剂乙（磷钨酸和磷钼酸混合液）在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质含量灵敏度较高。 实验步骤 标准曲线的制作：按