DGKζ、PKCβⅡ在不同毛色小鼠背部皮肤中的表达和定位.pdf

目 录 中文摘要Ⅰ 英文摘要 ….Ⅲ 前 言 1 1 材料与方法 3 1.1 实验材料 3 1.1.1 生物信息学分析材料 3 1.1.2 主要试剂 3 1.1.3 主要仪器4 1.2 实验方法 5 1.2.1 人和小鼠DGKδ 生物信息学分析 5 1.2.2 取材 6 1.2.3 皮肤组织总RNA 的提取纯化、反转录和分析 6 1.2.4 皮肤组织蛋白提取和分析 8 1.2.5 免疫组织化学ABC 法染色 9 1.2.6 统计学分析 10 2 结 果 11 2.1 人和小鼠DGKδ 生物信息学分析 11 2.1.1 人DGKδ 在各组织中的表达水平分析 11 2.1.2 人DGKδ 转录因子预测 11 2.1.3 人DGKδ 信号肽和跨膜结构域的预测 12 2.1.4 人DGKδ 亚细胞定位的预测 13 2.1.5 人DGKδ 同源性分析 13 2.1.6 小鼠DGKδ 转录因子预测 15 2.2 Real-time PCR 15 2.3 Western bloting 16 2.4 免疫组织化学ABC 法染色 17 3 讨 论 22 结 论25 参考文献 26 综 述29 参考文献 33 致 谢 35 个人简历 36 山西医科大学硕士学位论文 DGKζ 、PKCβⅡ在不同毛色小鼠背部皮肤中的表达和定位 摘要 目的： 探讨甘油二酯激酶δ（diacylglycerol kinase δ ，DGKδ ）、蛋白激酶CβⅡ（protein kinase CβⅡ，PKCβⅡ ）在不同毛色小鼠背部皮肤中的表达、定位及其与毛色形成的相关性。 方法： 1. 通过美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI ）官网，获取人和小鼠DGKζ 的序列；运用多种在线生物信息学 分析平台对人DGKζ 在各器官组织中的表达及其转录因子、编码产物的信号肽、跨膜 结构域、亚细胞定位预测分析，并对人DGK ζ的同源性进行分析；对小鼠DGKζ 序 列启动子所结合的转录因子进行预测。 2. 取2M 白、灰和黑色小鼠各6 只，去毛取背部皮肤，行Real-time PCR、Western blotting 和免疫组织化学ABC 法染色技术检测。 结果： 1. 生物信息学分析结果表明：DGKζ 在人体皮肤中表达；预测的人DGKζ 启动子 可能结合的22 个转录因子中ER-alpha、Sp1、p53 、c-ets- 1 和YYY1 这5 个转录因子 在黑素细胞中表达；人DGKζ 编码产物不存在信号肽剪切位点属非分泌蛋白，无跨膜 区域；主要定位于细胞核，亦定位在细胞质；人与黑猩猩、马、猫、灰仓鼠、牛、豚 鼠、野猪、大鼠、小鼠和鸡DGKδ 的氨基酸同源性分别为 99.8%、98.3%、97.7%、 96.6%、96.6%、96.4%、96.3% 、96.0%、96.0%、94.6%和78.6%，系统进化树分析发 现人与黑猩猩亲缘关系最近，与鸡的亲缘关系最远。预测的小鼠DGKζ 启动子可能结 合的13 个转录因子中ER-alpha、p53 和YYY1 这3 个转录因子在黑素细胞中表达。 2. Real-time PCR 检测显示，DGKδ 、PKCβⅡ在三种毛色小鼠背部皮肤中mRNA 表达趋势一致，均为：灰色组＞白色组；黑色组＞白色组，其差异具有统计学意义 （P0.05 ）；Western blotting 检测表明，显示PKCβⅡ活性的p-PKCβⅡ/ PKCβⅡ ，其变 I 山西医科大学硕士学位论文 化趋势与DG