软骨终板细胞印度刺猬蛋白表达对软骨终板退变的意义.pdfVIP

目 录 摘 要I Abstract IV 常用缩写词中英文对照表VIII 前 言 1 第一部分 人软骨终板不同阶段标本中Ihh 蛋白表达及其意义 2 1 材料与方法 2 2 结 果 9 3 小 结 11 4 第一部分实验附图 12 第二部分 人软骨终板细胞体外实验研究 14 试剂干预Ihh 表达的研究 14 1 材料与方法 14 2 结 果 22 3 小 结 26 4 第二部分实验附图1 27 质粒转染干预Ihh 表达的研究 30 1 材料与方法 30 2 结 果 35 3 小 结 39 4 第二部分实验附图2 40 讨 论 43 结 论 47 参考文献 48 综 述 51 骨髓间充质干细胞治疗椎间盘退变的临床研究进展 51 参考文献 57 致 谢 61 个人简介 62 山西医科大学硕士学位论文 软骨终板细胞印度刺猬蛋白表达对软骨终板退变的意义 摘 要 目的： 1. 观测不同阶段人软骨终板（CEP ）组织中印度刺猬蛋白（Ihh ）的表达情况； 2. 体外培养CEP 软骨细胞，观测Ihh 表达对软骨终板退变的意义。 方法： 第一部分：人软骨终板不同阶段标本中Ihh 蛋白表达及其意义 1. 收集2018 年5 月至2018 年12 月在我院手术治疗腰椎骨折、腰椎退变伴有终 板Modic Ⅰ和Ⅱ型患者的软骨终板标本。 2. 使用蛋白印迹（Western-blot ）和实时定量聚合酶链反应法（RT-qPCR ）检测 Ihh、软骨正性保护指标（Col Ⅱ、Sox9 ）和软骨肥大化指标（Runx2 、MMP-13）表达， 并通过对蛋白灰度值和mRNA 的表达水平分析。 第二部分：人软骨终板细胞体外实验研究 1 试剂干预研究 1. 体外分离软骨细胞培养至第3 代，分为3 组：对照组、Ihh 组和抗Ihh 组。 2. 分别添加PBS 、Ihh 重组蛋白液和抗Ihh 蛋白液后，培养3-5 天，使用Western- blot 和RT-qPCR 测定检测标本Ihh 及相关指标表达情况，免疫组化和原位杂交染色。 分析相关蛋白灰度值和mRNA 的相对表达水平，平均光密度值。 2 质粒转染研究 1. 体外分离软骨细胞培养至第3 代，分为3 组：过表达组、空载体组和敲减组， 分别使用Ihh mRNA 、空载体和Ihh siRNA 重组质粒转染软骨细胞，培养48h 。 2. 使用Western-blot 和RT-qPCR 测定检测标本Ihh 及相关指标表达情况，免疫 组化和原位杂交染色。分析相关蛋白灰度值和 mRNA 的相对表达水平，平均光密度 值。 I 山西医科大学硕士学位论文 结果： 第一部分：人Modic Ⅰ型和Ⅱ型椎板炎软骨终板组织标本中Ihh 蛋白及mRNA 相 对表达水平较正常组织中增高。与正常组织相比，软骨正性保护指标Col Ⅱ、Sox9 表 达降低（p 0.05 ），而软骨肥大化指标Runx2 、MMP-13 表达增高（p 0.05 ）。结果 中，Modic Ⅰ型与Ⅱ型软骨组织中的表达无差异性（p 0.05 ）。 第二部分： 1.原代CEP 组织软骨细胞呈类圆形，细胞贴壁后呈短梭型，传至第3 代贴壁细胞 呈短梭型，三角型细胞体积较小，折光性好。添加试剂后的3 组细胞，Ihh 组同一光 镜视野（40x ）下可见长梭型细胞比对照组及抗Ihh 组多。Ihh 组中 Ihh 及 Runx2 、 MMP-13 mRNA 指标表达量相对较高，Sox9 mRNA 的表达相对量较低（p 0.05 ）， Col Ⅱ mR