总RNA的提取电泳鉴定及.pptVIP

实验内容 1 、小鼠肝脏组织总 RNA 的提取 2 、 RNA 的琼脂糖凝胶电泳 3 、以 RNA 为模板进行 RT-PCR 4 、 PCR 产物的电泳及回收 实验一 . 提取小鼠肝脏组织的 RNA 一、真核细胞的总 RNA 1 、 mRNA: 1-5% 5` 鸟嘌呤 7 位甲基化 — CH 3 修饰。 1 ）免受核酸酶破坏， 2 ）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A) 尾巴结构 20--200 个 A. 翻译所必需。 起始密码： AUG 终止密码： UAA,UAG,UGA 。 2 、 tRNA: 10-15% 3 、 rRNA: 80-85% 大亚基 60S: 28S =4718nt 5S=120 nt 5.8S=160 nt 小亚基 40S: 18S =1874nt 二、 RNA 提取的注意事项 RNA 酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。 生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。 1 、 尽量避免外源性 RNase 污染 A. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。 B. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） C. 一次性塑料器材最好是新开封， (DEPC 水处理后）高压灭菌。 D. 玻璃器材、水都应该经过去 RNase 处理。 对玻璃器材还应该进行高温烘烤。 2 、抑制内源性 RNase 活性： RNase 抑制剂 。 RNA 分离的关键因素：避免 RNA 酶的污染。 1) 发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。 将 1 mL Trizol 试剂移入 Eppendorf 管中。 2) 实验教师操作 : 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块 不宜过大 , 放在玻片上立即研磨 , 研磨要彻底 。 3) 将研磨后的组织 ( 小米粒大小 ) 转移至 1 mL Trizol 试 剂 中 ， 盖 紧 盖 ， 上 下 颠 倒 混 合 2 min 以 上 。 使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑 浊状。 4) 室温孵育 10 min 。 三、 RNA 提取的实验操作 播放有声课件 1: RNA 提取方法及注意事项 1 、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细 胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase 的活性，通 过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总 RNA 。 特点：需低温操作，但价格经济。 2 、 Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总 RNA ， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3 、 mRNA 提取试剂盒 真核细胞 mRNA 的 3 末端有 ploy(A) 尾，利用寡聚 dT 纤维素结合 mRNA ，将其从细胞总 RNA 中分离出 RNA 提取的几种方法 室温孵育 10 min 介绍 RNase 抑制剂 1 、 DEPC ( 二乙基焦炭酸盐 ) 最常用的 RNase 抑制剂 : 与蛋白质中的组氨酸结合， 使蛋白质变性。 有效浓度： 0.05%---0.1%(DEPC 水 ) ，室温磁力搅拌 20 分钟。 用于浸泡各种器材。 灭活条件：高压。 在 Tris 溶液中半衰期为 1.25min 。 试剂的配制 : 无 RNase 的溶液 ( 用 DEPC 水配制 , 高压 ) 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。 4 ? C ，或液氮中。 2 、肝素： 使用浓度： 0.1 — 10mg/ml 效 果 : 37 ? C 时，可抑制 95% 的 RNase 活力。 如果与 DEPC 联合应用， 具有极强的抑制效果。 5) 加入 200 ? l 氯仿，震荡混匀 20-30 s ， 室温放置 5 min （此期间液体开始分层，不 要轻易搅动液体）。 6)10000 rpm ， 离心 5 min RNA ( 清澈透明 ) DNA Protein 7) 将清澈透明的 上层水相 转移至另一离心管中。 有声课件 2: RNA 干燥及溶解技巧 8) 沉淀 RNA ： 加 0.5 ml 异丙醇 ，上下颠倒混匀，室温 10 min 。 10, 000 ? rpm ， 4 ? C ，离心 10 min ．弃上清。 ９ ) 加 1ml 75% 乙醇 洗涤管壁。 ( 注意贴管壁在沉淀的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀 ) 10) 7500rpm ， 4 ? C 离心 1 min ，弃上清． 再离心几秒钟， 将管壁液体（用加样器）完全移净。 用 TriZol 试剂提取总 RNA 时，全程均在室温进行。 当 RNA 沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，操作要迅速。 11) 室温 干燥 3 － 5 min （根据 RNA 沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无 色胶样透明状，避免过分干燥 , 此 步骤非常关键 。） 注意事项