液相色谱-基础夯实篇.docxVIP

检测分析方法——高效液相色谱（一） 引言 在化学研究和工作中，首先需要解决的一大类问题就是：样品分析检测。分析检测的手段多种多样，而在这些分析手段中，大家最熟悉的手段莫过于：液相色谱了。液相色谱检测已经深入到需要定性定量分析的各个领域。下面就介绍下这种检测手段的相关知识。 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是:溶于流动相 (mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase) 发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由植物学家茨维特(Tswett)在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长(常有几个小时)。 图1 经典液相色谱法 Martin和Synge在1941年就提出高效液相色谱的设想，然而直到六十年代后期，由于各种技术的发展，高效液相色谱才付诸实现。高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography，HPLC) 是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。目前使用最多的名称是高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）。高效液相色谱已经广泛地应用，成为分析领域一项不可缺少的技术。 图2 现代液相色谱 图3 液相色谱柱 二、高效液相色谱法的特点和优缺点 高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点： ①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 ②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。 ③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在μL数量级。 ④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。 ⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。 此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 三、高效液相色谱法分类 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法(正相与反相)、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1. 液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附——解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2. 液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表而，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流功相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性;流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失;温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化;另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相);流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正