多酶辅助信号放大的核酸传感器设计及肿瘤标记物高灵敏检测.pdfVIP

摘 要 从古至今，恶性肿瘤疾病对人类生命健康的威胁甚为严重。K-ras 基因作为 肿瘤原癌基因，是维持生物机体正常生命活动所必需的基因，其在细胞内的异常 表达会引发肺癌，胰腺癌及结直肠癌等多种癌症。急性淋巴细胞白血病是属于人 体血液系统的肿瘤疾病，前期发病不明显，后期致死率高。在美国，每年约有 3000 至4000 人被诊断出患有急性淋巴细胞白血病，其中三分之二是2 到5 岁的 儿童。但是，随着科学技术的发展，科学工作者们逐渐发现恶性肿瘤的形成是基 于分子水平的事件，是遗传信息的改变所造成的。所以从核酸分子水平研究恶性 肿瘤疾病的发病机理，并对其进行早期的检测和筛查极为重要。在本工作中，我 们成功开发了三种基于新型探针的新颖DNA 生物传感器用于检测恶性肿瘤的核 酸生物标志物。实验结果表明所设计的DNA 生物传感器在基因检测方面显示出 了巨大的潜力，并在实际检测中具有广阔的应用前景。 首先，基于一种新颖的回文分子信标（PMB ），结合聚合酶介导目标循环的 信号放大技术，构建了一种高灵敏检测K-ras 基因的生物传感器。该传感方案中 的PMB 可以形成分子间二聚体，同时可以在聚合酶的存在下，使分子信标探针 能够以自身为模板进行延伸。并将目标基因置换下来，使其打开下一个分子信标， 从而触发链置换扩增反应。使得荧光信号大大增强，实现对K-ras 基因的高灵敏 检测，检测下限低至10 pM。此外，该传感系统还在复杂生物环境和实际样品的 检测中表现出优异的检测性能。 其次，基于含有 G- 四链体区域和核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）剪切区域的功能 化发夹探针（HP ），设计了一种无标记的DNA 传感器，用于急性B 淋巴细胞白 血病的生物标志物Pax-5a 基因的检测。发夹结构中的茎和G- 四链体等非单链片 段可以被一定浓度的 Exo Ⅲ消化，使得有无目标存在时的紫外信号产生差异变 化，从而实现对 Pax-5a 基因的超灵敏检测。该传感器对非目标基因具有良好的 判别能力，并且在含有血清的复杂生物环境中的检测能力也非常出色。 最后，我们利用多酶辅助信号放大的策略，构建了一种灵敏度更高的无标记 电化学传感系统，用于Pax-5a 基因的检测。在该传感系统中，Pax-5a 基因能够 在限制性核酸内切酶和聚合酶的作用下循环打开发夹探针，并生成大量的 G- 四 链体序列。Pax-5a 的超灵敏检测可通过G- 四链体/氯化血红素络合物在电极表面 催化H O 还原的反应来实现，传感系统的检测限低至4.6 fM 。该传感系统中的 2 2 酶促扩增反应过程在电极外部进行，这一做法降低了操作的复杂性，避免了电极 I 表面的吸附干扰。同时为我们以后传感器的构建提供了新的思路。另外，该生物 传感器具有良好的特异性和稳定性，并且在复杂的底物环境中也具有优异的检测 能力。 关键词：酶辅助循环扩增；信号放大；核酸检测；DNA 生物传感器；恶性 肿瘤；特异性检测 II Abstract Since ancient times, the threat of malignant tumor diseases to human health has been very serious. The K-ras gene, as a tumor proto-oncogene, is a gene necessary for maintaining the normal life activities of biological organisms. Abnormal expression of K-ras gene in cells can cause a variety of cancers such as lung cancer, pancreatic cancer and colorectal cancer. Acute lymphocytic leukemia is a tumor disease of the human blood system.