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miRNA 及其研究和应用 谢东君 2015202030079 RNA 在生命过程中的作用 ? mRNA —— 合成蛋白质的蓝图 ? rRNA —— 合成蛋白质的工厂 ? tRNA —— 合成蛋白质的搬运工 ? miRNA —— ??? 被关注的 RNA 研究 ? 2000 年, RNAi 的研究进展被 Science 杂志评为重大科技突破。 ? 2001 年, RNAi 作为当年最重要的科学研究成果之一,再次入 选“十大科技突破”。 ? 2002 年 12 月 20 日, Science 杂志将“ Small RNA RNAi” 评为 2002 年度最耀眼的明星。同时, Nature 杂志亦将 Small RNA 评 为年度重大科技成果之一。 ? 2003 年, microRNA 的研究第四次入选“十大科技突破”。 ? 2005 年, microRNA 的研究第五次入选“十大科技突破”。 ? 2006 年, RNAi 获得当年的诺贝尔生理学或医学奖。并且 microRNA 的研究第六次入选“十大科技突破”。 ? RNA 研究的突破性进展,是生物医学研究领域近 20 年来,可 与 HGP 相提并论的最重大成果之一。 什么是 miRNA miRNA 的发现 miRNA 的产生过程 miRNA 的作用机制 miRNA 的特点 ? 与其他寡核苷酸相比 , 主要有三点不同 : 1. 没有开放阅读框架及蛋白质编码基因的 特点 2. 通常的长度约为 22 个核苷酸 , 但在 3 端可 以有几个碱基的长度变化 3. 成熟的 miRNA5 端有一磷酸基团 , 3 端 为羟基 miRNA 的生物学功能 miRNA 的保守性 miRNA 靶基因的寻找 ? 尽管数百种 miRNA 在最近几年中被发 现了 , 但是只有非常少量的 miRNA 被 确定其作用 , 许多其他的 miRNA 基因 的作用还没有被阐明。因此发现 miRNA 的作用靶点成为了解其在不同 的生理过程中的功能的关键。 ? 目前主要利用生物信息学方法和生物 学实验方法寻找 miRNA 的靶基因。 生物信息学方法寻找 miRNA 靶基因 ? 生物信息学方法主要是利用某种算法对靶基因样本 进行评分及筛选。 ? 主要遵循以下几个常用原则 : 1. miRNA 与其靶位点的互补性 2. miRNA 靶位点在不同物种之间的保守性 3. miRNA-mRNA 双链之间的热稳定性 4. miRNA 靶位点处不应有复 杂二级结构 5. miRNA 5′ 端与靶基因的结合能力强于 3′ 端 ? 常用的算法有: miRanda 、 TargetScan 、 RNAhybrid 、 PicTar 、 miTarget 等 生物学实验方法寻找 miRNA 靶基因 ? 由于计算机模拟在预测 miRNA 靶基因时存 在一定的局限性 , 因此很多学者也希望能够 利用生物学实验方法直观地寻找 miRNA 靶 基因。 ? 一般可以从两个水平去寻找 miRNA 靶基因 1. 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因 2. 从蛋白质水平寻找 miRNA 靶基因 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因 —— 基因芯片法 ? 将 miRNA 成熟体双链或腺 病毒载体转染至细胞中 , 使 得 miRNA 在细胞中过表达 , 之后利用基因芯片分析 mRNA 的变化以找出相应 miRNA 的靶基因。 ? 由于 miRNA 在体内通过翻 译抑制或影响 mRNA 的稳 定性起作用 , 因此这种方法 在寻找起翻译抑制作用的 miRNA 的靶基因时存在一 定困难 . 从 mRNA 水平寻找 miRNA 靶基因 —— 免疫共沉淀法 ? 利用 AGO 蛋白家族既能结 合 miRNA 又能结合 mRNA 的特性 , 分别使用 AGO-1 和 AGO-2 蛋白的单克隆抗体 在人类细胞中进行免疫共沉 淀 , 得到与 AGO-1 和 AGO- 2 蛋白结合的 mRNA 各 600 条 , 并通过克隆测序对这些 mRNA 进行鉴定 . 同时从与 AGO-1 蛋白结合的 mRNA 中随机挑选 6 条进行荧光素 酶报告基因检测 , 发现其中 有 5 条都是 miRNA 的靶基 因 . 从蛋白质水平寻找 miRNA 靶基因 —— 细胞培养稳定同位素标记技术 分别将成熟 miRNA 双链转染 HeLa 细胞 , 利用细胞培养稳定同位素标记技术 (stable isotope labeling with amino acids in cell culture), 将转染了成熟 miRNA 双链的细 胞和正常细胞分别培养于含轻 /
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