医学生物化学基础及技术 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 电泳技术-3.聚丙烯酰胺凝胶电泳讲义.docVIP

聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电冰( polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物的一种电泳方法。该法有电泳基质的不连续体系(即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性)和连续体系(一层凝胶、一种pH和一种缓冲溶液)两种类型。 一、PAGE的性能及制备原理 (一)PACG作电泳支持物的优点 PAG是人工合成的多聚体，通过调节单体浓度和单体与交联剂的比例可以控制孔径变动在极广泛的范围。PAG机械强度好，有弹性且透明，相对地化学稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电作用。由于PAG纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。 用PAG作电冰支持物，凝胶制备的重复性好，设备简单，所需样品少(1-100pg)，分辨率较高。用此方法进行超微量分析时，可检出含量在10-9mol/L左右的样品。 PAGE应用范围很广，可用于蛋白质、酶、核酸等的定性、定量检测和少量的制备，还适合于生物分子相对分子量、等电点的测定及生物分子其他特性研究等。 (二)PAG制备原理 1.PAG合成催化系统 PAG聚合的催化体系有两种: (1)化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵( ammonium persulfate，简称AP)或过硫酸钾(KP)。此外，还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N- tetramethyl ethylenediamine，简称 TEMED)；其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈(3- dimethylaminopropionitrile，简称DMPN)。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合，低温或冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1h内完成，以便使凝胶的性质稳定。 (2)光聚合。光聚合通常用核黄素为催化剂，不一定加 TEMED即能聚合，但加入 TEMED可加快聚合速度。用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，核黄素经光解形成无色基团，后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。看来光聚合需要有痕量氧存在，但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。用核黄素进行光聚合的优点是:①核黄素的用量很低(1mg/100mL，对分析样品无任何不良影响； = 2 \* GB3 ②改变光照时间和强度，可以自由控制聚合时间。 两种聚合方法各有不足之处。化学聚合的凝胶孔径比光聚合的凝胶孔径小，而且重复性和透明度也比光聚合的好，但是过硫酸铵是强氧化剂，若存留于凝胶中往往会使某些蛋白质丧失活性，或者产生不正常的电泳图谱。制备小孔凝胶(分离胶)常采用化学聚合系统，采取预电泳的办法来除去过硫酸铵。而光聚合的缺点是形成的凝胶孔径较大，而且随时间延长会逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶(浓缩胶)较适合。为使光聚合的重复性良好，每次光照时间、强度均应一致。 2.聚合反应 PAG是用丙烯酰胺( acrylamide，简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(N,N- methylen, bisacrylamide，简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成。以化学催化系统为例，其聚合反应如下: (1)过硫酸根产生硫酸自由基 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链 将单体长链彼此之间连接成三维网状结构 从反应式中可看出，此凝胶是三维网状的带不活泼酰胺基侧链的碳链聚合 物，没有或很少带有离子侧基，因而凝胶性能稳定，无电渗作用。 3.凝胶组成和浓度的确定 (1)Acr和Bis量的确定。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于凝胶的浓度(T)和Bis在凝胶中的百分含量(交联度，C)。例如7.5%的胶，平均孔径5nm，30%的胶孔径为2nm。若Bis与Acr之比由1:15改变到1:60，则明显改变了凝胶的分子筛性质，使样品的相对迁移率增大，如乳酸脱氢酶的相对迁移率由0.148变到0.273。一般情况下，凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长，反之迁移速度快，电泳时间短。通常凝胶的筛孔、透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。 凝胶总浓度(T)的计算公式如下: 式中A代表Acr的重量(g)；B代表交联剂Bis的重量(g)；W代表溶液的体积(mL)。 交联度(C)可按下式计算: A与B的比值(W/W)对凝胶的筛孔、透明度和机械强度等性质也有明显影响。A/B100时，5%凝胶成糊状，且易断裂。要制备完全明而又有弹性的凝胶，应