如何选择蛋白印迹成像与定量分析关键技术.docVIP

怎样选择蛋白印迹成像和定量分析技术 　　westernblot技术在蛋白定量分析中选择应用 　　蛋白质印迹(westernblot)，它是依据抗原抗体特异性结合检测复杂样品中某种蛋白方法。westernblot是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来一种新免疫生化技术。因为免疫印迹(westernblot)含有SDS高分辨力和固相免疫测定高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析一种常规技术。免疫印迹(westernblot)常见于判定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 　　怎样选择蛋白印迹成像和定量分析技术?通常，WesternBlot显色方法关键有以下多个：1、放射自显影;2、底物化学发光ECL;3、底物荧光ECF;4、底物DAB呈色等。下面我们将分别对这四种方法进行介绍，同时向大家呈现每种方法应用特点。 　　放射自显影radioautography：利用放射性核素发射射线，使感光材料中卤化银等感光，显出影像后进行放射性标识物定位和定量测量技术。此技术特点是灵敏度高、分辨率好、保留时间长久，但因为试验所用方法性物质对人体有辐射作用，现在该技术在蛋白研究中应用较少，多用于研究标识化合物在机体、组织和细胞中分布、定位、排出和合成、更新、作用机理、作用部位等等。 　　底物DAB呈色：二氨基联苯胺(Diaminobenzidine,DAB)是辣根过氧化物酶最敏感、最常见显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹(WesternBlot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dotblot)和生物芯片(Biochip)等染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。此技术成本低，操作也较简单是常见westernblot成像分析技术之一，不过因为其灵敏度稍低，在目标蛋白表示量较少情况下可能没有理想结果应慎用。 　　底物化学发光ECL：化学发光是在某些特殊化学反应中吸收了反应释放化学能,而处于电子激发态反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生一种光辐射,化学发光分析是依据化学反应产物光辐射(化学发光)确定物质含量一种痕量分析方法。它特点是灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。 　　传统化学发光检测方法通常需要胶片成像，胶片成像能够确保较高灵敏度，但也有很多缺点：耗时，需要暗房和显影剂，胶片很贵，而且需要很多消耗品，需要连续购买。此外，用胶片上蛋白条带进行定量也是几乎不可能，和目测一块考马斯蓝染胶没什么区分，而且胶片成像时间只能预先设定，假如曝光过分或缺点则需要再次进行试验，很麻烦。 　　数字成像系统出现极大克服了传统胶片法某些弊端，多年来伴随冷却CCD技术发展，数字成像系统成本越来越低，成像效果同时获取大大提升，因而CCD成像系统逐渐成为了试验室WesternBlot关键设备。同时现在很多Westernblot新技术也全部是针对CCD成像系统，现在CCD成像系统灵敏度已经能够到达甚至超出传统胶片成像。冷却型CCD照相机和X胶片相比含有瞬时影像处置、高灵敏度、高分辨率、动力学范围广等优点，而且还不需要胶片处置装置、后续耗材投入及暗室。 　　底物荧光ECF：是利用荧光染料(如Cy2,Cy3,Cy5)标识二抗，标识荧光染料二 　　抗分别对应对应目标蛋白，以此实现经过检测荧光染料信号强度，实现种蛋白信号检测，以进行正确定量分析。荧光检测WesternBlot本来不是检测主流方法，不过荧光法检测答应在同一张转印膜上用差别颜色荧光底物同时检测差别目标。 　　在做westernblot检测时，有时会碰到电泳后两个分子量相近蛋白分离不开，距离相近或重合，比如磷酸化和非磷酸化蛋白;或是同一次试验中，检测一种以上蛋白抑或是利用内参蛋白对目标蛋白定量分析进行标准化。碰到以上这样试验需求，化学发光检测方法会显得繁琐复杂，其必需经过剥脱抗体和重行孵育新抗体过程，不仅耗时费力，而且不能进行正确定量分析，由此多色荧光成像技术应运而生。多色荧光成像，是利用差别荧光染料(如Cy2,Cy3,Cy5)标识二抗，标识差别荧光染绕二抗分别对应差别目标蛋白，以此实现经过检测差别荧光染料信号强度，间接实现一次试验可检测多个蛋白，同时也能够进行正确定量分析。 　　总而言之，经典westernblot技术结合不停进步科学技术，使蛋白定量分析更灵敏、操作愈加简便。同时，westernblot技术仪器也愈加专一、高效，这就要求我们在开展westernblot试验时，需要就怎样选择蛋白印迹成像和定量分析技术进行选择确定，以确保选择工具适用性。 此文章由广州深华生物技术有限企业编辑修改。