高效液相色谱法研究应用白藜芦醇光致异构化动力学与平衡常数.docVIP

高效液相色谱法研究白藜芦醇光致异构化动力学和平衡常数（一） 原标题：高效液相色谱法研究白藜芦醇光致异构化动力学和平衡常数 摘要：反式白藜芦醇有多个生理活性，自然资源丰富，但存在光不稳定现象。以光致异构平衡对照品溶液，采取高效液相色谱谱创建了同时测定顺、反异构体浓度方法。方法学考察显示符合含量测定要求，反式异构体在１.５～６０μｍｏｌ／Ｌ、顺式异构体在１.５～５５μｍｏｌ／Ｌ范围内线性关系良好，Ｒ２均达０.９９９。将该方法应用于研究光致异构化动力学及平衡常数，结果显示反式白藜芦醇在室温避光条件下中性、偏酸性及乙醇介质中稳定；２５℃时在５０％（ｖ／ｖ）乙醇介质中光异构平衡常数为１１.７±０.３。以光致异构平衡液制作标准曲线策略简单方便，含有可操作性；反式白藜芦醇稳定性和介质相关，在ｐＨ＜７溶液中光致异构化为一级反应。 白藜芦醇（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ，Ｃ１４Ｈ１２Ｏ３，５?（４?ｈｙｄｒｏｘ?ｙｓｔｙｒｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ?１，３?ｄｉｏｌ）自然资源丰富，最少在２１个科３１个属７２种植物中发觉，如：蓼科Ｐｏｌｙｇｏ?ｎａｃｅａｅ植物虎杖ＰｏｌｙｇｏｎｕｍｃｕｓｐｉｄａｔｕｍＳｉｅｂ．ｅｔＺｕｃｃ．干燥根茎和根、葡萄科植物葡萄Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ果实皮和籽、豆科Ｆａｂａｃｅａｅ植物花生Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ种子等。白藜芦醇是一种生物活性很强天然多酚类化合物，又称为芪三酚，是一种天然抗氧化剂，可降低血液黏稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，预防癌症发生及发展，含有抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂作用。植物中关键以反式异构体存在，有报道反式异构体在光、热作用下可转化为顺式异构体，并有报道前者生理活性强于后者，但迄今还未见报道光致异构化动力学及在差别介质溶液中稳定性研究。本文以光照后到达平衡反式异构体对照品溶液作为顺式异构体对照品溶液，采取ＨＰＬＣ创建同时测定光照溶液中顺、反式异构体含量方法，以测定室温避光和光照后差别介质中顺、反式异构体含量，研究稳定性及动力学，以期为白藜芦醇应用和开发提供研究基础。 １试验部分 １．１仪器和试剂 ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅ２６９５ＨＰＬＣ，配Ｗａｔｅｒｓ２９９６ＰＤＡ检测器（美国Ｗａｔｅｒｓ企业）、Ｅｍｐｏｗｅｒ软件。 乙腈为色谱纯；乙醇、高氯酸、浓盐酸、无水枸橼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水碳酸钠、碳酸氢钠均为分析纯；水为重蒸水。 称取适量反式白藜芦醇（中国生物制品检定所，含量＞９８.５％），用５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液配制成１ｍｍｏｌ／Ｌ反式对照品贮备液，低温避光储存。 ｐＨ１.２溶液：取含量为３６％盐酸８.５ｍＬ，用蒸馏水稀释至１０００ｍＬ，调节ｐＨ至１??２；ｐＨ４??０缓冲溶液：将０.１ｍｏｌ／Ｌ枸橼酸溶液１２３ｍＬ和０.５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液７７ｍＬ混合，摇匀；ｐＨ７.４缓冲溶液：将０.０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液８１ｍＬ和０.０５ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液１９ｍＬ混合，摇匀。ｐＨ９.０缓冲溶液：将０.００２ｍｏｌ／Ｌ无水碳酸钠１０ｍＬ和０.００２ｍｏｌ／Ｌ碳酸氢钠９０ｍＬ混匀，调节ｐＨ至９.０。 １．２溶液准备 异构化试验溶液准备以下。取反式对照品贮备液适量，分别以ｐＨ１.２水溶液、１０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液（ｐＨ４）、５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液稀释至３０.０μｍｏｌ／Ｌ，置于无色一般透明玻璃瓶中，２５℃室内自然光下放置，在０、０.２５、０.５、１、２、３、４、５、６、７ｈ分别取样以ＨＰＬＣ法进行测定。 避光稳定性试验溶液准备以下。取反式对照品贮备液适量，分别以水溶液（ｐＨ１.２、７.４、９.０）、１０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液（ｐＨ４）、５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液（ｐＨ７.４）和５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液稀释成３０.０μｍｏｌ／Ｌ，置于棕色玻璃瓶中，２５℃避光放置，在０、１、６、１２、２４、７２ｈ取样以ＨＰＬＣ法进行测定。 低温避光稳定性试验溶液准备以下。取上述异构化试验溶液准备中５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液稀释异构化溶液再继续在低温（４℃）下避光放置，分别在１、３、５、１０、１５ｄ取样以ＨＰＬＣ法进行测定，考察顺、反式溶液在低温下稳定性。 １．３标准曲线溶液制备 反式异构体标准曲线溶液：取反式对照品贮备液，以５０％（ｖ／ｖ）乙醇溶液制成１.５０、３.００、６.００、１５.００、３０.００、６０.００μｍｏｌ／Ｌ溶液，置于棕色玻璃瓶中避光保留。 顺式异构体标准曲线溶液：取上述反式异构体标准曲线溶液适量，置于无色一般透明玻璃瓶中，２５℃室内自然光下放置５ｈ，取样以ＨＰＬＣ法进行测定。以初始反式异构体浓度减去对应平衡溶液中反式异构体浓度，得到顺式异构体浓度依次为１.５０、２.７７、５.５２、１３.８５、２７.７０、５５.２２μｍｏｌ／Ｌ。 １．４色谱条件 色谱柱Ｋｒ