中枢神经系统发育过程Shh对神经元迁移和轴突生长的影响.pdfVIP

新乡医学院硕士学位论文 目 录 摘要1 Abstract3 前言6 材料与方法8 结果19 讨论43 结论48 参考文献49 综述：SonicHedgehog信号通路在神经系统的作用55 附录65 攻读学位期间发表文章情况66 致谢67 个人简历68 新乡医学院硕士学位论文 中枢神经系统发育过程Shh对神经元迁移和轴突生长的影响 摘 要 背景 脑和脊髓是中枢神经系统的重要组成部分，其发育受到严格的调控。在脊髓和大 脑皮层的发育过程中，神经元的形态以及迁移都发挥着重要的作用，其时空发育只有 得到正确的调节，才能发挥对应的功能。大量研究表明Shh （Sonichedgehog）能够促 进神经前体细胞的增殖，进而影响脊髓以及大脑皮层的发育，但Shh对神经元的迁移 以及突起形成是否存在影响尚不清楚。本实验通过过表达Shh，以期研究Shh在脊髓和 大脑皮层神经元发育和迁移中的功能。 目的 1. 建立小鼠胚胎脊髓和大脑皮层体外电转后组织片培养技术。 2. 研究Shh对脊髓发育过程神经元轴突生长及迁移的影响。 3. 研究Shh过表达对大脑皮层神经元迁移的影响。 方法 1. 取E12和E13.5胚胎小鼠，体外将pCAGGS-GFP质粒分别注入脊髓腔和侧脑室 并进行电转，切片培养。48h后固定染色，观察形态结构以及单个神经元在组织片中 的迁移等。 2. 将Shh过表达载体pCAGGS-Shh转入SH-SY5Y细胞，E12脊髓片以及E13.5大脑 皮层，验证Shh能否在细胞-组织-活体三个水平上过表达。 3. 将GFP和Shh质粒电转入E12小鼠胚胎脊髓腔，切片并培养48h，染色观察神经 元结构；利用子宫内电转技术将GFP和Shh质粒转入E13.5小鼠胚胎室管膜，E16.5取材， 固定切片并染色，研究Shh过表达对神经元迁移以及形态是否存在影响。 4. 将GFP和Shh质粒转染进入SH-SY5Y细胞中，观察GFP阳性细胞的突起伸出情 况，随后提取蛋白，通过Westernblot检测相关蛋白的表达。 结果 1. 在培养的脊髓片和脑片中能够观察到转染侧GFP阳性细胞，说明该方法能成功 1 新乡医学院硕士学位论文 的将外源基因转入脊髓以及大脑皮层的神经前体细胞。 2. 根据SH-SY5Y细胞Westernblot结果，脊髓片和大脑皮层免疫荧光染色结果表 明，Shh过表达载体能够在细胞-组织-活体中实现Shh过表达。 3. Shh在培养了48h后的脊髓片中过表达后，通过MAP2 （Microtubule-associated protein 2）染色以及测量突起长度发现，Shh过表达抑制神经细胞突起的形成。 4. 通过MAP2，DCX （doublecortin）染色以及统计各层GFP阳性细胞比率发现， Shh过表达抑制E13.5大脑皮层神经元迁移。 5. Shh在SH-SY5Y 细胞中过表达发现大多数细胞突起变短或变成球状。Western blot结果显示实验组中CyclinD1，c-Myc和PCNA的表达水平明显增加，而黏附相关的 N-cadherin的表达水平下降。 结论 1. 建立了小鼠胚胎脊髓及大脑皮层体外电转和组织片培养结合观测神经元变化 的技术，为研究小鼠脊髓和大脑皮层发育提供一种有效的方法。 2. Shh过表达影响脊髓神经元突起的形成，进而影响脊髓的发育。 3. Shh过表达通过抑制大脑皮层神经元的迁移从而影响大脑皮层的发育。 关键词： Shh；脊髓；大脑皮层；神经元；电转 2 新乡医学院硕士学位论文 Effect of Shhonneuronal migration andaxon growthinthe