质粒转化步骤.docVIP

ADDIN CNKISM.UserStyle质粒转化步骤 SOB培养基（用于菌种扩增） 胰化蛋白胨 20g 酵母提取物 5g NaCl 0.5 g KCl 0.186g MgCl2 0.95g 用去离子水定容至1L，在121℃高压下蒸汽灭菌20min。 琼脂SOB培养基（用于制备固体培养基） 胰化蛋白胨 20g 酵母提取物 5g NaCl 0.5 g KCl 0.186g MgCl2 0.95g琼脂粉 15g 用去离子水定容至1L，在121℃高压下蒸汽灭菌20min。 SOC培养基（用于菌种复苏） 除含有20 mmol/L的葡萄糖外,其他成分与SOB培养基相同。SOB培养基经高压蒸汽灭菌后,让其冷却至60℃或60℃以下，加入20mL无菌的1mol/L葡萄糖(该溶液的配方是将18g葡萄糖溶解于90mL去离子水中。待完全溶解后，用去离子水定容至100mL，0.22um滤器过滤除菌)。 操作步骤： 1.从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞。用手掌握住小管解冻细胞。待细胞解冻后，将小管转移到冰浴中。将细胞置于冰上10min。 2.使用预冷的无菌吸头将感受态细胞转移到预冷的1.5ml聚丙烯管。加入转化DNA(每50μL感受态细胞中最多加入10ng)，体积不超过感受态细胞的5%。轻轻旋转小管多次，混匀。将管子置于冰上30min。将细胞置于冰上应避免使用玻璃管，因为它们可降低约10倍的转化效率。 注：细菌转化必要的对照在每次实验中应设有阳性对照，以测定转化效率；并设置阴性对照，以排除污染的可能性，以及确定实验失败的潜在原因。 阴性对照：转化实验中设置一份感受态细胞不添加DNA。将此份细胞平铺于一个含有适当抗生素的、用于筛选转化体的琼脂平板上。此平板上应该无茵落长出，没有涂布细菌的选择性平板也应如此。如果有茵落长出,考虑以下可能性。 a在实验过程中感受态细胞被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。可能转化方案中使用的溶液/试剂被污染。 b选择性平板有问题。可能是忘记了在平板中添加抗生素或者加入抗生素时琼脂太热。 c选择性平板被具有抗生素耐药性的细茵菌株污染。在这种情况下，菌落通常同时出现在培养基的表面上和琼脂中 阳性对照：用已知量的、标准制备的环状超螺旋质粒DNA转化一份感受态细胞此对照将测定此次转化的效率，并提供了与以前的转化实验相比较的一个参照）。 3.将管子置于预热的42℃水浴中，若质粒大于8000bp，热激90s，如果小于8000bp，热激60s。热激过程中不要摇动管子。热激是至关重要的一步，细胞以适当的速率上升到正确的温度是非常关键的，热激的时间一定要严格控制。 4.迅速地将管子转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。 5.每管加入800μL SOC培养基（无氨苄）。在水浴中将培养物加热到37℃，然后将管子转移到振荡培养器中37℃培养45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。 6.将合适体积(至多200μL/90mm平皿)的转化感受态细胞转移到含20 mmol/L MgSO4 和合适抗生素的琼脂SOB培养基中。采用玻璃曲棍球棒或玻璃珠法使菌液均匀涂布，玻璃珠法操作如下： a.提前将玻璃珠转移到聚丙烯管中，每管4~ 6个。高压灭菌消毒珠子。 b.当接种物转移到琼脂平板后,打开一管无菌的玻璃珠,并将玻璃珠倒到平板上 c.缓慢地来回摇动平板,每隔几秒钟将平板旋转大约90°，目的是让玻璃珠按平板的直径方向运动，而不是环绕其周边。 d.持续摇动2~3min。如果平板是叠置的，几个平板可以同时摇动。 e.平板充分摇动后，将平板倾斜到一侧去除玻璃珠，打开盖子，将玻璃珠倒入含洗涤溶液的烧杯中。 f.收集到足够多的脏玻璃珠时,可以用去离子水洗涤,高压灭菌并重复使用。 当采用氨苄青霉素筛选时，转化细胞应以低密度(小于104菌落/90mm平皿)平铺，并且平板在37℃解育不应超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体产生的β-内酰胺酶分泌到培养基中,可以迅速使菌落周围区域的抗生素失活。因此,铺板密度过高或孵育时间过久会导致氨苄青霉素敏感的卫星菌落产生。在选择性培养基中使用羧苄青霉素而不是氨苄青霉素,并且把抗生素浓度从60μg/mL提高到100μg/mL，该问题可以得到部分改善，但不能完全消除。氨苄青霉素抗性菌落的数量并不会随着铺板的细胞数目呈线性增加，这也许是由于抗生素杀死的细胞释放出的生长抑制物质造成的。 7.在室温下放置平板直至液体被吸收。 8.将平板倒置并在37℃孵育。转化后单菌落应该在12~16h出现。 9.挑取单菌落，可依据获取质粒的数量来选择不同规格的容器进行摇菌。于摇床37℃，180r/min进行摇菌。12-16小时可用于质粒提取，同时可以进行保菌。保菌方法如下： a液体培养基生长在平板上或液体培养的细菌可在含15%无菌甘油的SOB培