菌种传代与复苏.docxVIP

4.1菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制 备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的 菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡， 因此菌种传代与保藏是一 项重要的基础工作。 4.2菌种代号 国内药品微生物检验所用的菌种代号是 CMCC(F)或CMCC(B) , CMCC--中国医学菌种 保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠杆菌 CMCC(B)44102 枯草芽弛杆菌 CMCC(B)63501 白色念珠菌 CMCC(F)98001 黑曲霉 CMCC(F)98003 4.3传代和接种 4.3.1菌种冻干粉复苏 4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌 1ml滴管、双碟、镶子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面 数支，移入接种室或净化台。 4.3.1.2先用砂轮将冻干菌种安甑瓶颈部挫出挫痕， 再将冻干菌种管外壁用 75%酒精擦 洗消毒，稍干，用 75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封 口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端， 是骤冷而炸裂。 4.3.1.3取灭菌镶子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌 滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许， 加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管 内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内， 并将滴管及菌种管投入消毒液内， 将已接 种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。 4.3.2菌种斜面传代操作 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名 及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约 30分钟，待温度平衡后再移入接种 室或超净工作台。 4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端， 将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过 3次。左手将管 口在火焰上旋转烧灼，右手无名指， 小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞， 将接种环深入管内先 在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环， 并将 菌种管口移至火焰旁。 4.3.2.3堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞， 将接种环深入管内至琼脂斜面的底部， 由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动， 使细 菌划在斜面的表面上。 4.3.2.4取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火 焰上烧灼灭菌。4.4菌种的培养与保存 大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时 金黄色葡萄球菌 30-35摄氏度培养 48小时 枯草芽弛杆菌30-35摄氏度培养48小时 白色念珠菌23-28摄氏度培养7天 黑曲霉23-28摄氏度培养7天 将培养物管自培养箱取出后放入冰箱 （2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。 4.5菌悬液的制备 4.5.1取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌 苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置 35-37摄氏度培养 18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。 4.5.2取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液） 1ml,加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液 混匀，为10-1,再取另一只刻度吸管吸取 10-1菌液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液中混 匀，为10-2......以此类推，稀释至含活菌数在 50-100个。用平板计数。 4.5.3此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在一周内使用。 TOC \o 1-5 \h \z 4.7记录 4.7.1传代和接种使用后，应做好〈〈菌种传代接种记录》 。 4.7.2菌悬液制备后，应做好〈〈菌液制备使用记录》 。 依据：中国药典2015年版二部及菌种使用说明书 标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心( China Medical culture collection ,CMCC )提供的冷冻干燥菌种 (0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面 (3 代)。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孑包子悬液冷存管。 中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 CMCC (B)代表细菌(bacteria ) ,CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。 标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安甑装的冻干菌， 接收同时应检查是否有随菌 种附有的相关资料。接收菌种时应检查安甑的数量和名称， 和每一支安甑的完整性。在相应 的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息， 如