角化细胞培养研究进展.ppt

角化细胞 (KC) 培养研究进展 提纲 ? KC 来源及分化过程 ? KC 的作用 ? KC 培养方法 ? 滋养层细胞培养 ? 无滋养层细胞培养 ? 影响 KC 培养的的因素 ? 霍乱毒素 (CT) 、表皮生长因子 (EGF) 和钙离子 (Ca 2+) 一、 KC 来源及分化过程 KC 来源及分化过程 皮肤主要由 表皮 和 真皮 组成， 中间由基底膜隔开； 表皮由上至下分别为 角质层 、 颗粒层 、 棘层 和 基底层 ； KC 主要来源于基底层 。 1. 皮肤结构和 KC 来源 KC 来源及分化过程 表皮干细胞 定向祖细胞 终末分化 KC 凋亡 KC 10- 14d 干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大； 而 定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点 。 桥粒和角化包膜形成 2.KC 分化过程 二、 KC 的作用 KC 的抗菌作用 1. KC 通过 PRR 识别病原体 Kollisch 等 (2005) 用 RT- PCR 方法发现 KC 可表达 不同的 TLR 亚型。 PGN 、 poly (I:C) 和 flagelli 可 分 别 与 KC 的 TLR2 、 TLR3 和 TLR5 结 合，从不同程度刺激 KC 分泌 IL-8 说明 KC 可通过 TLR 识别细菌上的病原相关分子模式 (PAMP) ，分泌 IL-8 等物质清除病原体。 KC 的抗菌作用 2. KC 分泌 AMP 杀灭病原体 Glaser 等 (2005) 用抗菌测 试 试 验 发 现 抗 菌 肽 S100A7 可特异性的杀死 大肠杆菌。 ONG 等 (2005) 研 究 发 现 LL-37 能有效杀灭葡萄球 菌。 KC 在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的 AMP 。阳离子抗菌肽主 要有 LL-37 、 防御素 和 S100 蛋白家族 ( Harder and Schroder, 2005) 。 三、 KC 的培养方法 ? KC 培养最早始于 1967 年 (Briggaman 等， 1967) ， 随后人们陆续培养出 鼠 (Marvin 等， 1971) 、 兔 (Liu 等， 1978) 和 狗 (Wilkinson 等， 1987) 等的 KC 。 ? 使用的培养方法包括 滋养层培养法 和 无滋 养层培养法 。 滋养层细胞培养 1. 以 3T3 细胞作为滋养层 1975 年， Rheinwald 等首次 成功地在体外连续培养人正常 KC 。 他们把射线灭活的鼠 3T3 细胞作 为滋养层，将胰蛋白酶消化后的 单个 KC 接种于其上，发现 KC 能 明显抑制 3T3 细胞，且自身生长 良好，并将 3T3 滋养层细胞不断 推至培养皿边缘 。 图中红色为 KC ，蓝色为 3T3 细胞 滋养层细胞培养 1. 以 3T3 细胞作为滋养层 Alain 等 (1986) 用 3T3 滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊 KC 。 5d 18d 滋养层细胞培养 2. 以成纤维细胞作为滋养层 Alain 等 (1989) 首先介绍了用自体成纤维细 胞代替 3T3 细胞作为滋养层，成功培养了 人头皮毛囊 KC 。 真皮成纤维细胞 丝裂霉素 C 或射线 有丝分裂后细胞 成纤维细胞滋养层 KC 接种 6d 3week s 滋养层细胞培养 ? 优点： 细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定； 而且灭活的 3T3 细胞自身无生长能力，有利于接种的 KC 生 长增殖。 ? 弊端： 一反面可能会造成 KC 和 3T3 细胞的混合污染，另 一方面存在着将 3T3 细胞 DNA 遗传信息整合入增殖的 KC 内的危险。 无滋养层细胞培养 Wilkinson 等 (1987) 率先用无滋养层方法成功分离培养了狗 KC 。 皮肤组织 分离酶 4℃ 孵育 18h 表皮 KC 培养、传代 20℃ 孵育 45min 特定培养基 吸管吹吸 无滋养层细胞培养 Hager 等 (1999) 用无滋养层方法成功分离培养了小鼠 KC ，并将其传至 第 19 代 ，但 只有前 10 代细胞具有分化能力。 真皮 胶原酶 纱布过滤、离心 混合细胞 成纤维细胞 成纤维细胞条件培养基 HCM EMEM.06 EMEM.06(1:1) KC 培养基 无滋养层细胞培养 Caldelari 等 (2000) 在