DNA测序结果中常见的几个问题.docVIP

1 、 为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别 这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致， 该干扰峰和正常序列峰重叠在一起； 另外， 测序电泳开始阶段电压有一个稳定期， 所以经常有 20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚， 有时甚至更长。 2 、 为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂 由于测序反应的信号是逐渐减弱的， 所以序列末端的信号会很弱， 峰图自然就会杂乱， 加上 测序胶的分辨率问题， 如果碱基分不开， 就会产生 N 值，正常情况下 ABI377 测序仪能正确 读出 500 个碱基的有效序列。 3 、 测序结果怎么找不到我的引物序列 如果找不到测序所用的引物序列。 这是正常的， 因为引物本身是不被标记的， 所以在测序报 告中是找不到的； 如果找不到克隆片段中的扩增引物， 可能是您克隆的酶切位点距离您的测 序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别， 有可能看不清或看不到扩增引物；另外插 入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。 4 、 测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点 可能的原因同上， 您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近， 开始一段序列很杂， 几乎难以 辨别， 有可能看不清或看不到酶切位点。 通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物， 当 然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。 5 、 你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事 首先， 我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号， 如果对应的是您的样品， 由于不 知您的实验背景， 测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断， 我们能做到的是检查 发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。 6 、 序列图为什么会有背景噪音 ( 杂带 ) 是否会影响测序结果 序列图的背景杂带是由荧光染料引起， 如果太强会影响测序结果， 要看信噪比， 我们给的结 果信噪比大都在 98%以上。 7 、测序 结果为什么与标准序列有差别 原因可能有： 样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非 100%，建议至少测一次双向， 通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。 当然尽管我们有 时做了最大努力， 但还是保证不了和文献序列完全一致， 但我们测序报告是客户样品序列的 真实结果。 8 、 PCR 产物测序与克隆后测序序列为什么有差别 PCR 产物克隆到载体中进行测序，有两个方面可能序列有变化：首先， PCR 扩增过程中可 能产生错配。将片段克隆到载体中也有可能发生突变；其次，测序的准确率并非 100%。 9 、 有杂合位点，但你们的报告上看不到杂合的信号！ 如果在您认为应该出现杂合信号的位置上只出现单一的信号， 那么可能是您样品突变的模板 与正常的模板的比例没达到可以测出的浓度。 测序反应的信号强度直接与模板的量有关， 如 果突变的模板所占的比例很低， 仪器会自动将它作为背景信号了， 很难检测出来。 只有当测 序反应体系中正常的和突变的模板量比较接近时， 才能较可靠地检测到突变体的存在。 其次， 在同一位置， 不同碱基的信号强度一般是不一样的， 这样即使突变的模板所占的比例较高时， 也不一定能准确检测到突变的存在， 因为， 测序仪是主要用来测序正常的碱基序列的， 软件 分析结果时，会尽量提高主峰而将背景信号尽量压低，以得到尽可能好的结果。尊重结果， 我们是不会人为将出现单一的信号修改为杂合位点的。 10 、 DNA 测序样品用 TE 溶液溶解好不好 由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一种潜在的抑制物 , DNA 的测序反应也是 Taq 酶的聚合反应， 需要一个最佳的酶反应条件 , 因此 DNA 测序样品溶解时，最好用灭菌水溶解。 11 、 我送什么形式的菌体样品好 菌体的一般形态有、菌液，平板培养菌、穿刺培养菌，甘油保存菌等。我们建议客户所送的 形态以方便且不易受污染为准则，推荐穿刺培养菌。 上海客户用过夜培养好的菌液 2 ml 。 12 、 为什么你们给我的序列是反的 测出来的结果与您预期的方向并不一致 , 可能是片断插入方向是非定向的，这在 PCR 产物 T/A 克隆中较常见。 有时， 客户要求的测序引物离克隆位点较近， 如果反向引物相对克隆位 点较远，为得到更好的结果， 我们会选择反向引物测序， 若是这种情况， 用看图软件 Chromas 可以把图反转过来，就可得到正向序列。 13 、 Template mixed 为何种情况 测序结果表现为套峰，测序反应信号很好，测序结果杂乱 , 即同一个位置有二个峰。 原因可能有：样品并非单一模板、 PCR 产物中有杂带、质粒为双克隆产物、引物特异性不 高，有两个结合点， PCR 产物电泳