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蛋白质定向进化技 (DE technology of Protein  蛋白质定向进化技术 DE( directed evolution of protein)始于上 世纪70年代,最早的一个例子是进化一个来源于 大肠杆菌的EbgA蛋白,这个酶几乎不具备β 半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一碳源的平 板上筛选Lac-缺失的大肠菌株,野生型的Eb gA就进化成为了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。  蛋白质定向进化技术 ★定义( definition) ★原理( theory) ★随机突变的策略( marked features) ★定向进化的选择的策略( methods) ★应用及展望( application and prospects)  蛋白质定向进化技术 定义 定向进化技术是一种在生物体体外(试管 中)模拟达尔文进化,利用自然选择的动 力进化出在自然界并不存在的或是具有更 优性质的蛋白。  蛋白质定向进化技术 自然选择 分子定向 进化 生物在漫长的时 基因在短时间内 间里经过自发突变( 通过人为引发突变 突变与重组),通过 经过人工筛选,形成 白然选择,逐渐形成 满足人们需要的新功 了多样性的生物。 能或者优良性能生物 物质(酶蛋白) 自发、不定向、自然选择、慢 人为、定向、人工选择、快  蛋白质定向进化技术 原理 DE的原理是对目的基因进行突变、重组、表达和 筛选在试管内模拟蛋白质的自然进化过程获取 人们需要的、具有特定性质和功能的蛋白质。 定向进化=随机突变十选择  随机突变的策略 ■易错PCR ■DNA改组和外显子改组 ■杂合蛋白质 ■体外随机引发重组 ■交错延伸  蛋白质定向进化技术 ●易错PCR 易错PCR是指通过改变PCR的反应条件,如: 调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg2+的 浓度等,使碱基在一定程度上随机错配而引入多 点突变,构建突变库,刷出所需的突变体。易错 PCR的关键是控制DNA的突变频率。  蛋白质定向进化技术 DNA改组 DNA改组又称有性PCR,目的是创造将亲本基因 群中的突变尽可能组合的机会,导致更大的变异, 最终获得最佳突变组合的蛋白质 单一基因成 相关DNA 序列或家族 ↓DN 随机片段化 片段组装和基因重组 突变重组子 负突变重组子 图1 DNA shuffling原理 ○:负突变表型;●:正奕变表型 Fig. 1 DNA shuffling procedure  蛋白质定向进化技术 ●杂合蛋白质 把不同蛋白质分子的结构单元或整个蛋白质分子 进行组合或交换,以产生具有所需性质的优化蛋 白质杂合体。