蛋白相互作用Pull-Down实验.docx

蛋白相互作用Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知 的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。 用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST 和多组氨酸（6X His ）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲 2+ 2+ 和配体（如Ni和Co ） o Ptiase 1In vitro Proy Protein Synlhosis Ptiase 1 In vitro Proy Protein Synlhosis (TNT*T7SySl?n) PhasB 2 Immobilization of Bair tG ST-fusion) Protein onto MagneGST? Panides proy prntGin detociedWash proy prntGin detocied Wash Wash Elute J |gst|-C + Q Figure 1 Overview of the MjgneGST? Pull-Down System protocol P h Prey Protein, M = MagneGST? PjtftKk. 实验准备： 实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶(镍离子琼脂糖凝胶) 、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液 实验试剂： Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na 2HPO4、2mM KH2PO4、 140mM NaC、l 10mM KCl SDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8) 、 2%SD、S 0.1%溴酚蓝、 10%甘 油、 10mM DTT 裂解缓冲液： 20mMTris-Cl(pH8.0) 、 200mM NaCl、 1mM EDTA(pH8.0)、 0.5% Nonidet P-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。 ( 蛋白酶抑制剂： 2ug/ul 抑肽 酶( aprotinin )、1ug/ul 白胃素( leupeptin )、 0.7ug/ml 胃酶抑素( pepstatin )、 25ug/ml 苯甲磺酰氟( PMSF)) 实验方法： 方法一： 1、预清除细胞裂解液： 将细胞裂解液与50ul的50%?胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在 4C混合 孵育 2h。 离心机12,000g在4°C离心2min。 将上清转移至新的离心管中。 2、探测细胞裂解液 两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul ?胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。 在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。两 个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在 4C翻 转混合孵育 2h。 最大速度在4C离心样品2min。 在新的微量离心管中收集上清。 用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心 1ml。弃去上清。 重复洗三次。 加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST融合蛋白及任何 与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心 2min。 将洗脱蛋白质与等体积的2X SDS-PAG上样buffer混合。 3、检测相互作用蛋白质 将样品煮沸4min,进行SDS-PAG凝胶电泳分析。 方法二： 1、 5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在 4 C孵育结合30min。 2、 结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与 100ul细胞裂解液结 合在4 C作用4h。 3、 3000rpm在4C离心5min,除去上清。 4、 用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠， 3000rpm在4C离心5min, 除去上清,重复 5 次。 5、 取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAG电泳分析。 方法三： 实验试剂： PBS(140mM NaC、l 2.7mM KCl、 10mM N2aHPO4、 1.8mM KH2PO4) Elutio n Buffer: 50mM Tris-CI(pH8.0) 、10mM还原型谷胱甘肽 0.154g 溶解 到 50ml 50mMTris-Cl(pH8.0) 中配制 Elution Buffer 。 1 、细胞裂解 取 1ml 细菌培养液离心去上清, 加 200ul 细胞裂解液到菌丸, 在室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育 20-30min。 2、固定GST融合蛋白到柱子上 将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 2