胍基乙酸影响肌源性分化和肌肉生长的miRNA调控途径研究.pdfVIP

摘要 近年来研究表明，胍基乙酸（Guanidinoacetic acid, GAA ）作为一种内源性动物 组织（包括肌肉和神经）的氨基酸衍生物，可以增强肌肉的生长性能。MicroRNA （miRNA ）是一种十分保守的非蛋白编码RNA ，可直接降解靶基因mRNA 或抑制其 翻译，在营养介导的肌细胞生成中，miRNA 作为一种转录后调节因子起着关键的作 用。然而GAA 对肌源性分化和骨骼肌生长的影响以及miRNA 在这个过程中潜在的 调节机制尚未阐明。本研究利用不同浓度的GAA 处理C2C12 细胞，测定细胞增殖和 分化过程中相关基因的表达水平，研究GAA 对C2C12 细胞增殖、分化和肌管生长的 影响；利用 small RNA-seq 和 qRT-PCR 鉴定 GAA 处理组和对照组间差异表达的 miRNA ，将miR-133a-3p 和miR-1a-3p 作为GAA 影响C2C12 细胞功能的候选调控因 子，进一步在细胞水平进行功能验证；利用生物信息学方法预测 miR-133a-3p 和 miR-1a-3p 的靶基因，通过双荧光素酶报告实验验证靶基因的准确性；利用不同浓度 GAA 饲喂小鼠，在活体水平对实验结果进行验证。本研究旨在探究GAA 在肌肉发育 过程中发挥作用的miRNA 途径。研究结果如下： （1）GAA 剂量越高，C2C12 成肌细胞分化能力越强。C2C12 细胞可以利用GAA 增加细胞的肌酸浓度，GAA 处理后的 C2C12 细胞增殖率减少，促进细胞增殖的 CCND1 和 CDK4 的表达水平下调，抑制细胞增殖的P21 表达水平上调。与此同时， GAA 处理促进了MyoD 和MyoG 基因的表达，增加了肌管融合率。GAA 饲喂小鼠后， 腓肠肌的MyHC 的蛋白水平上调，腓肠肌横截面积增加。 （2 ）GAA 通过miRNA 调节肌生成过程。small RNA 测序（对照1、对照2 、GAA 处理1、GAA 处理2 ）得到11.42M~14.76M 的原始reads ，分析显示总共有8 种miRNA （包括miR-133a-3p 和miR-1a-3p ）在GAA 处理后出现差异表达；差异表达miRNA -63 的靶基因功能富集分析显示，它们与细胞分化（469 个基因，p = 3.64×10 ）、Wnt -4 -4 信号通路（31 个基因，p = 1.15×10 ）、PI3K-Akt 信号通路（63 个基因，p = 9.45×10 ） 和AMPK 信号通路（26 个基因，p = 0.012 ）相关。 （3 ）GAA 处理使miR-133a-3p 和miR-1a-3p 的表达量下调，从而促进肌肉的发 育。GAA 处理组的细胞肌管直径增加了40% ，MyHC 的蛋白表达水平升高，GAA 饲 喂小鼠后降低了小鼠腓肠肌中miR-133a-3p 和miR-1a-3p 的表达，MyHC 蛋白水平提 高。通过过表达/抑制表达miR133a-3p 和miR-1a-3p，转染有miRNA 抑制剂的细胞肌 I 管直径明显增加，并且 miR-133a-3p 和 miR-1a-3p 抑制剂的共转染具有协同效应， qRT-PCR 和蛋白质印迹法分析显示miRNA 抑制剂转染的细胞肌管中MyHC 蛋白表 达水平显著增加（特别是miR-133a-3p 和miR-1a-3p 抑制剂共转染）。 （4 ）miR-133a-3p 和miR-1a-3p 通过靶向Insr 和EIF4E 调节Akt/mTOR/S6K 信 号通路来影响肌肉生长。通过生物信息学分析和双荧光素酶报告实验证明 Insr 和 EIF4E 分别为miR-13