qPCR结合ddPCR对肉中羊源性成分定量检测方法的建立.pdfVIP

中文摘要 我国拥有庞大的畜禽肉消费群体，但目前国内外肉类掺假情况却令人堪忧， 许多不良商家为使利益最大化，用廉价肉、劣质肉替代或是部分替代高价肉的手 段来达到目的，这严重损害了消费者的利益，也对市场监管带来不利影响。而目 前的检测方法主要是定性或半定量技术，对非法添加还是无意污染无法准确区分。 本研究建立的方法主要运用了实时荧光定量 PCR 和微滴数字 PCR 检测技 术，实时荧光定量PCR 在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监 测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。而数字PCR 利 用有限稀释法和根据泊松分布统计原理来计算DNA 浓度，无需标准曲线，且不 受不同样品和试验过程中PCR 扩增效率变化的影响，就能实现低至单个拷贝核 酸分子的绝对定量。而方法中加入的内标物种与样品同时进行前处理、提取和 PCR 扩增，能够有效减少客观因素对结果的影响。 研究运用实时荧光定量PCR 与微滴数字PCR 检测技术建立了羊源性成分定 量检测方法，主要研究结果如下： （1）研究选取了羊、牛源性成分的单拷贝基因进行引物探针的设计，通过对多 个物种的基因组序列进行同源性比对，选取目标物种的特异性保守区域，分别设 计了羊、牛源性的特异性通用引物探针，并对反应体系进行条件优化。设计的两 对引物、探针都具有良好的特异性，均只与目标物种发生反应，未发生非特异性 扩增，检测体系具有良好的扩增效果。 （2 ）研究了不同的样品前处理方式对羊肉基因组DNA 定量的影响，包括标准品 制备方法的重复性及稳定性研究、动物基因组DNA 不同提取方法的比较研究以 及样品中添加不同种类与不同含量的基质肉对羊肉基因组DNA 的提取和qPCR 扩增的影响。研究结果表明，实验所用的标准样品制备方法重复性和稳定性较好， 4 种提取方法中磁珠法更适合用于动物基因组DNA 的提取，不同种类的基质肉 对羊肉基因组DNA 的提取与扩增几乎无影响，实验结果无明显差异。 （3 ）基于基因拷贝数构建了样品中羊肉含量与Ct 值的数学模型，进一步建立了 qPCR 定量检测方法，最终能仅对样品DNA 进行qPCR 就直接计算样品中羊肉 含量。实验结果表明：方法建立的函数关系都具有良好的线性，R2 均大于0.99 。 I 方法具有良好的重复性和稳定性，检测限为5%，具有较好的准确性。 （4 ）建立了ddPCR 内标定量方法，向样品中添加一定量内标后提取DNA ，运 用双重 ddPCR 分别测定目标和内标的基因拷贝数，构建检测目标与内标的拷贝 数比值与样品质量的函数关系，结果表明：方法建立的函数具有良好线性关系， R2 均大于0.99 ，且方法稳定性、重复性和准确性都满足定量要求，定量检测限达 5%，可应用于实际检测。 （5 ）应用本论文建立的qPCR 绝对定量方法和ddPCR 内标定量方法，对成都海 关技术中心提供的28 份羊肉样品进行了定量检测，对两种定量方法的检测结果 进行了分析。 综上所述，本研究基于qPCR 和ddPCR 建立的羊源性成分定量检测方法， 能够快速、有效地对样品中的羊源性成分进行定量检测，特异性强且结果准确， 可为相关执法部门提供可靠依据。 关键词：羊源性成分，实时荧光定量PCR ，微滴式数字PCR ，绝对定量，内标， 掺假检测 II Abstract China has a large population of livestock and poultry meat, but the current situation of adulteration of meat at home and abroad is worrying. Many bad businesses have to maximize the benefits, replace them with cheap meat, inferior meat or partially replace high-priced meat. The purpose, which seriously damages the interests of consumers and also has