1型鸭肝炎病毒VP1截短表达蛋白的应用.pdfVIP

摘 要 鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis ，DVH) 主要是由 1 型鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus 1 ，DHAV-1) 引起的、针对雏鸭的一种高传染性和高致死率的传染病。 迄今为止对DHAV-1 临床检测手段主要采用中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附 试验等。本研究通过DHAV-1 VP1 优势抗原区域的筛选截短表达5 个蛋白，以VP1-a （1-60aa）重组蛋白制备兔抗DHAV-1 多克隆抗体；建立了以VP1-a 作为包被抗原的 间接ELISA 方法。为临床上DHAV-1 和DHAV-1 血清的快速诊断检测提供了方法。 1. VP1 蛋白截短片段原核表达 通过生物信息学软件DNAStar 以及在线蛋白质分析网站对DHAV-1 VPl进行抗 原性分析，综合分析结果选取VPl 蛋白的5 个抗原性较强的区域进行截短，将截短 蛋白的DNA 序列克隆至pET-32a(+)表达载体中，选用表达菌Rosetta(DE3) ，37 ℃、 0.4 mmol/L IPTG 诱导表达6 h，获得与预期大小相符的重组蛋白VP1-a、VP1-b、 VP1-c、VP1-d 和VP1-e 。Western blot 分析表明，除截短重组蛋白VP1-d 不能与鸭 抗DHAV-1 阳性血清反应外，其余4 个截短重组蛋白均能与鸭抗DHAV-1 阳性血清 反应并以VP1-a 的反应最强烈。本研究表达得到的4 个具备良好反应原性的截短重 组蛋白为DHAV-1 及抗体的检测提供了基础材料。 2. 兔抗DHAV-1 VP1-a 高免血清的制备和应用 选取重组蛋白 VP1-a 并切胶纯化后免疫兔，获得VP1-a 的多克隆抗体，间接 ELISA 方法检测抗体效价为 1:512000。用制备的兔抗VP1-a 高免血清分别进行间 接免疫荧光和免疫组化检测DHAV-1 在体外DEF 感染细胞及感染鸭肝组织内病毒 的分布情况，结果显示在体外DEF 感染细胞中病毒主要分布在细胞质，少量分布 在细胞核；感染鸭肝组织中病毒主要分布于肝细胞的细胞质。上述实验说明兔抗 VP1-a 高免血清能很好地识别DHAV-1，表明构建的重组蛋白VP1-a 具有良好的免 疫原性和反应原性，其制备的抗体可用于DHAV-1 的检测。 3. 基于VP1-a 蛋白的间接ELISA 方法的建立 用VP 1-a 蛋白作为包被抗原建立检测DHAV-1 抗体的间接ELISA 方法。最佳 抗原包被浓度为2.875 ng/μL，最佳血清稀释度为1:160，最适二抗稀释度为1:400； 最佳封闭液为5% BSA；阳性临界值为0.461，阴性临界值为0.394，介于二者之间 判定为可疑；板内平均变异系数为2.43% ，板间平均变异系数为3.15%；不与鸭瘟 病毒、鸭流感病毒、鸭坦布苏病毒等免疫血清发生交叉反应。VP1-a 与DHAV-1 全 病毒作为包被抗原的间接 ELISA 检测方法同时检测临床样本，两种方法的符合率 是84%。因此，应用VP1-a 重组蛋白作构建的间接ELISA 方法特异性强、重复性 好，可以用于DHAV-1 临床血清抗体的检测。 关键词：DHAV-1 ；VPl 截短蛋白；间接ELISA ；免疫荧光；免疫组化 ABSTRACT Duck Viral Hepatitis (DVH) is mainly caused by Duck Hepatitis A Virus 1 (DHAV-1), which is an infectious disease with high infectiousness and high lethal rate. Until now the clinical detections of DHAV-1 are include neutralization test、indirect hemagglutination test and enzyme linked immunosorbent assay etc. This research constructed five recombinant protein of DHAV-1 VP1 gene superior antigen region, and choose VP1-a