细胞超微结构与电镜技术：透射电镜的原理和应用.pptx

透射电镜的原理和应用;;光有波动性, 碰到物体会发生衍射. 光学透镜由玻璃制成, 通过不同外形角度,使光线折射,形成不同长短的聚焦像点 ? 波长越短, 分辨率越高 ? 电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用, 轨迹也发生弯曲,( 折射) ? 电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜; 电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用, 轨迹也发生弯曲,( 折射) ? 电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜 （如图） 在这种静电场中， 前一半是电透镜，通过电透镜电子轨迹已向轴心折射。， 在通过后半个磁透镜（对称磁场）加速之后，形成的电子轨迹具有会聚的特性。;;;; 照明系统组成：由电子枪、聚光镜（1、2级）和相应的平移对中、倾斜调节装置组成。作用：提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度高、束斑小、束流稳定的照明源。为满足明场和暗场成像需要，照明束可在20-30范围内倾斜。 电子枪电子枪是电镜的电子源。其作用是发射并加速电子，并会聚成交叉点。 目前电子显微镜使用的电子源有两类：热电子源——加热时产生电子，W丝，LaB6场发射源——在强电场作用下产生电子，场发射电镜FE热阴极电子源电子枪的结构如图2-2所示，形成自偏压回路，栅极和阴极之间存在数百伏的电位差。电子束在栅极和阳极间会聚为尺寸为d0的交叉点，通常为几十um。 栅极的作用：限制和稳定电流。;;;;;;? (1)特点? 物镜是一块强磁透镜，焦距很短，对材料的质地纯度、加工精度、使用中污染的状况等工作条件都要求极高。致力于提高一台电镜的分辨率指标的核心问题,便是对物镜的性能设计和工艺制作的综合考核。尽可能地使之焦距短、像差小，又希望其空间大，便于样品操作，但这中间存在着不少相互矛盾的环节。??? (2)作用? 进行初步成像放大，改变物镜的工作电流，可以起到调节焦距的作用。电镜操作面板上粗、细调焦旋扭，即为改变物镜工作电流之用。??? 为满足物镜的前述要求，不仅要将样品台设计在物镜内部，以缩短物镜焦距；还要配置良好的冷却水管，以降低物镜电流的热飘移；此外，还装有提高成像反差的可调活动光阑，及其要达到高分辨率的消像散器。对于高性能的电子显微镜，都通过物镜装有以液氮为媒质的防污染冷阱，给样品降温。;;;;; 1.观察室??? 透射电镜的最终成像结果，显现在观察室内的荧光屏上，观察室处于投影镜下，空间较大，开有1～3个铅玻璃窗，可供操作者从外部观察分析用。对铅玻璃的要求是既有良好的透光特性，又能阻断X线散射和其他有害射线的逸出，还要能可靠地耐受极高的压力差以隔离真空。;;;成像原理; ;;;;二、超薄切片技术 ? ? 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞超微 结构最常用的技术。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在10 ～100nm的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作的过程包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节 ，和一般光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片切片过程更为细致与复杂，要求更严格，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体操作步骤、注意事项如下： ?;1．取材和前固定：快速的切取大小为0.5～1.0mm3的样品块，一分钟内把组织（样品） 块浸入2.5％戊二醛（进口品质）溶液（取样前来平台领取），每个离心管内装 20个以上的样品块，作为一个样送到平台。 要求：①取材前一定要和工作人员取得电话联系！②取材选择部位要准确可靠，确保 每块材料都是要观察的部位。③所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽真空15mins，不能沉底的样品一定要抽真空致沉底！④细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心沉淀后送到平台，由平台工作人员处理。⑤泡在前固定液的材料最多可以放2周。 ?;2．漂洗：用1M?PBS?Buffer?Ph?7.2冲洗3次，每次15mins。? 3．后固定：加入1％锇酸处理到样品变黑。植物样品一般处理2.5hours，真菌、细菌一般处理2hours，动物样品处理1hours。注意事项：①锇酸剧毒物质，易挥发，操作时要在毒品柜中谨慎使用。②锇酸比较昂贵，需特别节约使用。 4．漂洗：用1M?PBS?Buffer?Ph?7.2冲洗3次，每次15mins。? 5．脱水：室温下，丙酮0％－50％－70％－80％－90％每级作用30mins， 纯丙酮在作 用3次，每次作用30mins。? 6．?渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物样品需要的渗透梯度多、渗透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以 二叶龄水稻叶片为例，其渗透流程如下：无水丙酮/包埋剂＝5：1作用12hours→无水