CCK8 检测细胞增殖毒性的原理及注意事项.docVIP

CCK8检测细胞增殖/毒性得原理、方法及注意事项 一、CＣK8检测细胞增殖/毒性得原理? Cell　Couｎtiｎg Kiｔ－8(简称CＣK—8)试剂可用于简便而准确得细胞增殖与毒性分析。其基本原理为:该试剂中含有WSＴ-8【化学名:２—(2-甲氧基-4-硝基苯基)－３-(4-硝基苯基)－５-(２,4—二磺酸苯)—2H—四唑单钠盐】,它在电子载体１—甲氧基-5－甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1—Methoｘｙ PＭＳ)得作用下被细胞中得脱氢酶还原为具有高度水溶性得黄色甲瓒产物(Foｒmazan dyｅ)。生成得甲瓒物得数量与活细胞得数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖与毒性分析。??用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 CCK8得优点: 使用方便,省去了洗涤细胞,不需要放射性同位素与有机溶剂; CCＫ-8法能快速检测; CＣＫ-8法得检测灵敏度很高,甚至可以测定较低细胞密度; CCK-8法得重复性优于MTT　法; CCK-8法对细胞毒性小; ＣCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液,毋需预制,即开即用、 ?CCK８得缺点: 与ＭTT法相　比,CCＫ8与ＸＴT得价格比较贵、 CCK８试剂得颜色为淡红色,与含酚红得培养基颜色接近,不注意得话容易产生漏加或多加、 ?与以往得增殖/毒性测定试剂相比较:? 检测方法 MTT法 XTT法 ＷST-１法 CＣＫ8法 甲臢产物得水溶性 差(需加有机溶剂溶解) 好 好 好 产品性状 粉末 2瓶溶液 溶液 1瓶溶液 使用方法 配成溶液后使用 现配现用 即开即用 即开即用 检测灵敏度 高 很高 很高 高 检测时间 较长 较短 较短 最短 检测波长 560-600nm 4２0-4８０nm ４2０-480nm 4３0-490nm 细胞毒性 高,细胞形态完全消失 很低,细胞形态不变 很低,细胞形态不变 很低,细胞形态不变 试剂稳定性 一般 较差 一般 很好 批量样品检测 可以 非常适合 非常适合 非常适合 便捷程度 一般 便捷 便捷 非常便捷 ?二、CCＫ8检测细胞增殖／毒性得方法? 实验一:细胞增殖分析１、制备细胞悬液:细胞计数 2、接种到96孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约1００ul细胞悬液,同样得样本可做3个重复、 3、3７℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。?4、加入１0ｕｌ CCＫ8:由于每孔加入CCK8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀、或者直接配置含1０％CCＫ８得培养基,以换液得形式加入。?5、培养1-4小时:细胞种类不同,形成得Fｏrmazan得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件、特别就是血液细胞形成得Ｆorｍazan很少,需要较长得显色时间(5—6小时)。 6、测定450nｍ吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长4５0-490nｍ,参比波长６０0—6５0nm、 实验二:细胞毒性分析１、制备细胞悬液:细胞计数 2、接种到96孔板中:根据合适得铺板细胞数,每孔约10０ｕl细胞悬液,同样得样本可做3个重复。 3、37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2－4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去、 ４、加入不同浓度得毒性物质 5、37℃培养箱中培养:加入毒性物质得培养时间,要瞧毒性物质得性质与细胞得敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上得时间。?6、加入10ｕl CCK8:由于每孔加入ＣCK８量比较少,有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。?７、培养1—4小时:细胞种类不同,形成得Forｍaｚａn得量也不一样。如果显色不够得话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别就是血液细胞形成得Ｆoｒｍaｚan很少,需要较长得显色时间(5—6小时)、 8、测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长４50－490nm,参比波长600-650nｍ。 注:? 若暂时不测定ＯＤ值,可以向每孔中加入1０　μＬ 0、1M得HCＬ溶液或者１% ｗ/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下。２4小时内测定,吸光度不会发生变化。 如果待测物质有氧化性或还原性得话,可在加CCK8之前更换新鲜培养基(除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新得培养基),去掉药物影响。当然药物影响比较小得情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后得空白吸收即可。 ?三、CＣK8检测细胞增殖/毒性得注意事项? 当使用标准９６孔板时,贴壁细胞得最小接种量至少为1,０0０ 个/孔　(１０0 μl　培养基)。检测白细胞时得灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2,500 个/孔　(1００ μｌ 培养基)、 酚红