生物化学与分子生物学进展：分子克隆技术常用的工具酶.pptVIP

3）底物性状 随底物的不同而活性发生改变 某些限制酶对线性DNA和超螺旋DNA底物的活性有所不同。如Eco R I、Pst I和Sal I酶解超螺旋pBR322 DNA时的用量比酶解同样量λDNA的用量至少需要增加5倍量的酶。 由于限制酶活性单位一般是用λDNA为底物确定的，因此，对非λDNA底物进行酶解时，最好作些预实验，以寻找最适酶用量的条件。 底物位点优势 有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率也有差异，称为底物位点优势。 最常见的是Hind Ⅲ对λDNA的消化产物中4.3 kb带的荧光亮度常比2.3 kb和2.0 kb带还浅，显示Hind Ⅲ对该片段位点的切割效率低于其他位点，表现出位点优势效应。 此效应于1975年已被发现，但其机制尚未阐明， ①与不同位点上碱基的甲基化修饰有关， ②可能与识别序列外的DNA空间结构或某种化学修饰有关。 4）试剂：缓冲系统 必须用有足够缓冲能力的缓冲液以维持反应最终的适当pH 。 Tris缓冲系统是最广泛应用和不利因素最少的，但其温度系数大，其pH亦可受浓度的影响，稀释时须重测pH； 反应pH大于9时，常选用甘氨酸缓冲系统； 要求pH6.0～7.5时，磷酸缓冲液是个好的缓冲系统，温度系数小，但磷酸缓冲液仅用于后续的酶促反应不受磷酸根离子抑制的系统，如磷酸盐会抑制末端标记和连接反应；通常的酚抽提和乙醇沉淀不能有效地去除磷酸根离子；能络合Mg2+的柠檬酸盐和其他生物缓冲试剂不宜使用。 5）限制酶活性不良的可能原因及解决措施 酶已失活， 反应体系中有抑制剂存在， 缓冲液组成或反应温度不适， DNA已甲基化、未甲基化或其他修饰， DNA的纯度未达到， 底物中没有所选酶的识别序列， 电泳凝胶的浓度不适，等等。 7 限制片段末端的连接作用 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAA AATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAA AATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 能识别限制酶识别的序列，并把其中的某些碱基甲基化（常见使限制酶识别序列中的C或A甲基化修饰)，属修饰酶类。 经修饰的DNA不再被限制酶降解。 已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在对应II类限制酶名称前加一个M表示。 如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲基化(GAm6ATTC)的酶 识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至少有3种： ①敏感的，甲基化后不能再切割； ②不敏感的．甲基化后仍可切割； ③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。 一、大肠杆菌DNA聚合酶 I 1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性 dTTP 5 5 A T G C A A T T G C 3 | | | | 3 T A C G T 5’ 5’ 引物 5’ A G C T T C A G G A T A ? 3’ | | | | | | | | | | | 3’ T C G A A G T C C T A T C G A C 5’ ? 3’? ? 5’?外切酶活性 5’? ? 3’?外切酶活性 能切除突变的 DNA片段 能辨认错配的碱基对，并将其水解 G C 2）核酸外切酶活性 小片段 N 端 C 端 木瓜蛋白酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 5? ? ??核酸外切酶活性 大片段 （ Klenow 酶 ） DNA聚合酶活性 ?? ? 5? 核酸外切酶活性 二、Klenow 酶 1: 随机引物标记核酸探针 2: 5’-粘端补平或3’端标记 3: 合成cDNA的第二链 4: DNA序列分析 5: 3’-端的末端标记 三、逆转录酶 逆转录 mRNA DNA 以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。 1975年，H.Temin