生物化学与分子生物学进展：核酸序列分析.pptVIP

霰弹法测序的缺点 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，各个片段重叠或一个连续体的概率是2n2-2n 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。 拼接错误：Repeat的存在 Whole Genome Shotgun This bacterium has a circular genome structure with 2,689,445 base pairs, the second largest one of thermophiles decoded completely to date. Circular representation of the genome of T. tengcongensis 世界大型基因组研究中心 美国：1) National Human Genome Research Institution in NIH 2) Genome Center at White Head/MIT 3) Washington University Genome Center 4) Joint Genome Institution at DOE 5) Genome Center at Baylor Medical Collage 英国：Sanger Center 日本：RIKEN 中国：华大基因研究中心（北京、杭州） 国家人类基因组中心（北京、上海） 染色体步查法(chromosome walking) 限制性酶切—亚克隆法(Restriction endonuclease digestion and subcloning)  染色体步查法(chromosome walking) (1)方法： 在人类和其它动物的定位克隆可用染色体步查法－用邻近的标记为探针，在基因组文库中筛选重叠克隆。直到目的基因被克隆出。 (2)步查的方向和进度可通过中期染色体原位分子杂交来确定。 (3)大范围染色体步查有困难，因存在重复顺序而不能进行分子杂交。 参考书目 Sanger双脱氧终止法测序的原理． 大规模基因组测序的两种策略 　逐步克隆法 　全基因组霰弹法 3. DNA测序技术经过30余年的发展，经历了第一代、第二代，发展到第三代测序法，其各有何特点及优势。（课后查阅资料） 4. 如何对所获DNA序列进行初步分析？ （课后查阅资料） Thank you * * * * * * 化学测序时DNA片段的末端标记及载体选择 可选用pSp64CS或pSP65CS载体 MG法与Sanger法的比较 MG法 Sanger法 试剂 硫酸二甲酯、肼 单链模板、寡核苷酸 引物、DNA聚合酶 重复性好，易掌握 操作简便，节省样品 来自原DNA分子 体外复制后的产物 测定序列 优点 降解反应 合成反应 化学反应 较短 较长 测序读长 应用较少 应用广泛 应用 基因组，指的是生物体内的所有DNA，包括它的基因。人类基因组计划要测定的是人体23对染色体中的所有DNA的序列，它由31.647亿个碱基对组成，共有3万至3.5万个基因。换句话说，生命天书是由30多亿个字写成的，如果将这30多亿字排版到一张报纸上，那么大约需要20万页纸才能排完这部巨著。 由此可以想见，读取这部巨著所要耗费的时间将是如何的惊人。 解读生命的“天书”---人类基因组计划 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????? 基因组测序策略 DNA测序不能从染色体进行，首先必须克隆化，构建基因组的物理图谱。先构建片段DNA克隆(以YAC或BAC为载体)，并把克隆依染色体排序，这就是“染色体的克隆图”。依片段DNA克隆在染色体上所在的位置排序，可以得到相互重叠的一系列克隆，叫做“克隆重叠群”(contig)。选取有关的克隆进行DNA测序，就可以“拼装”出整个染色体或基因组的DNA序列。如果克隆片段太大仍不便于直接测序，则需通过亚克隆，构建更小的片段。 另外一种方法是对所有相互重叠的亚克隆进行测序，然后直接通过计算机程序根据其重叠部分进行“拼装”。 大规模基因组测序的两种策略 逐步克隆法 （Clone by Clone） 全基因组霰弹法 （Whole Genome Shot-gun) ………ATGCCGTAGGCCTAGC